6 Resultados e Discussão

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1 6 Resultados e Discussão No presete capítulo são descritos os resultados obtidos ao logo das etapas de desevolvimeto, validação (icluido a estimativa da icerteza de medição) do método aalítico por cromatografia eletrociética capilar micelar utilizado detecção espectrofotométrica a região do UV-Vis, além dos resultados das aálises de amostras visado à determiação das vitamias K1 e K Desevolvimeto do método aalítico por cromatografia eletrociética capilar micelar Para desevolver o método aalítico por cromatografia eletrociética capilar micelar foram realizados testes para seleção do sistema de solvetes adequado ao método (item 6.1.1); estudos para defiição da composição do eletrólito de corrida para obteção de migração difereciada para as duas vitamias K (item 6.1.); e otimização de parâmetros experimetais e istrumetais críticos para a garatia de boa resolução a separação dos aalitos (item 6.1.3) Testes de solubilidade Sedo as vitamias K substâcias lipossolúveis, iicialmete, para o desevolvimeto da metodologia aalítica, foi realizado um estudo visado ecotrar um sistema de solvetes adequado para dissolver os aalitos e que fosse compatível com a abordagem por eletroforese capilar, já que a técica escolhida para a separação das mesmas (MEKC) ormalmete é realizada em meio aquoso. Testes foram realizados tomado como base algus trabalhos da literatura (Cao et al., 009; Souza, 008) que evolvem a separação de substâcias eutras. Os seguites sistemas foram testados: i) H O + SDS (8,8 g.l -1 ), ii) H O:MeOH 95:5% v/v, iii) H O:MeOH 95:5% v/v + SDS (8,8 g.l -1 ), iv) ACN:H O

2 10 30:70% v/v, v) H O:ACN 95:5% v/v, vi) H O:ACN 95:5% v/v + SDS (8,8 g.l -1 ). No etato os resultados ão foram satisfatórios, pois em ehum dos testes houve dissolução completa de ambos os aalitos. A vitamia K3 foi completamete solúvel em todos os meios testados, porém quado a vitamia K1 foi adicioada, todos os sistemas testados se apresetaram turvos, idicado solubilização icompleta de compoetes. Sedo o SDS um surfactate aiôico optou-se, em um primeiro mometo, por modificar o tipo de surfactate utilizado, alterado para um surfactate catiôico, o caso, o CTAB. Em soluções cotedo até 90% v/v de água foi possível dissolver ambas as vitamias K1 e K3. Sedo assim, o sistema de solvetes eleito foi uma solução cotedo: H O:ACN 90:10% v/v + CTAB (18, g.l -1 ) Composição do eletrólito e codições prelimiares de aálise A composição do eletrólito de corrida foi otimizada de modo a se obter a migração difereciada para as duas vitamias K. Iicialmete utilizou-se 5,5 g.l -1 de CTAB, 0% de acetoitrila e solução tampão em diferetes faixas de ph. A acetoitrila foi itroduzida como modificador químico de modo a melhorar as características de migração e garatir a solubilização dos aalitos o meio essecialmete aquoso e com alta força iôica. Os seguites tampões foram utilizados: acetato (ph 4,0), fosfato (ph 6,7; 7,0; 7,4 e 7,9) e borato (ph 8,5). Para os testes iiciais, com base em procedimetos descritos a literatura para separação de outras espécies eutras por EC (Frazier et al., 000), utilizou-se temperatura de 5 C, difereça de potecial de 5 kv e tempo de ijeção de amostra de 15 s. Utilizado-se o tampão acetato, ão foi possível visualizar picos de absorvâcia das vitamias. Na Figura 11 são apresetados os resultados obtidos com o tampão fosfato, observado-se uma divisão do pico da vitamia K3. Os melhores resultados foram obtidos utilizado-se o sistema tampão borato a cocetração de 3,1 g.l -1, apresetado uma completa separação dos picos de absorvâcia das vitamias K1 e K3 (Figura 1).

3 Absorvâcia (mau) Absorvâcia (mau) d 100 c b 50 0 a Tempo de migração (mi) Figura 11: Eletroferogramas das vitamias K3 (pico 1) e K1 (pico ) em uma mistura padrão (K1: 1,8 x 10-1 g.l -1, K3: 6,9 x 10 - g.l -1 ). Eletrólito de corrida: 5,5 g.l -1 de CTAB, tampão fosfato 6,8 g.l -1 (a: ph 6,0; b: ph 7,0; c: ph 7,4; d: ph 7,9), 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, V = 5 kv, T = 5 ºC e detecção em 48 m Tempo de migração (mi) Figura 1: Eletroferograma das vitamias K3 (pico 1) e K1 (pico ) em uma mistura padrão (K1: 1,8 x 10-1 g.l -1, K3: 6,9 x 10 - g.l -1 ). Eletrólito de corrida: 5,5 g.l -1 de CTAB, tampão borato de 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, V = 5 kv, T = 5 ºC e detecção em 48 m. Em separações de substâcias eutras, o ajuste do ph tem pouco efeito sobre a seletividade, o etato, deve-se selecioar um valor de ph para o

4 104 sistema o qual as micelas do surfactate se ecotrem ioizadas de tal forma que permita sua migração em uma taxa diferete da taxa do EOF. Optou-se por mater costate tato a cocetração quato o valor de ph de 8,5 do tampão borato utilizado os testes iiciais por terem se apresetado satisfatórios, resultado em uma boa separação dos aalitos essas codições (Figura 1). Em relação ao percetual de solvete orgâico, o caso a acetoitrila, presete o eletrólito de corrida, optou-se, após aálise dos resultados, por matê-lo em 0%. Solvetes orgâicos miscíveis em água como a acetoitrila provocam redução do fator de reteção, alterado, portato a seletividade da separação. Os mesmos quado adicioados a solução do eletrólito de corrida alteram a polaridade da fase aquosa do eletrólito causado um aumeto a atração do aalito para essa fase. No etato, se presetes em alta cocetração podem dividir a estrutura da micela, sedo recomedado portato que a fração de volume ão exceda 30% da composição (Frazier et al. 000) Otimização de parâmetros críticos para separação eletroforética Defiidas as codições prelimiares de trabalho, estudos uivariados dos parâmetros experimetais e istrumetais críticos foram realizados de modo a se cohecer a ifluêcia de cada uma das variáveis e otimizá-las, garatido boa resolução a separação dos aalitos Parâmetros experimetais Na codição iicial escolhida observou-se que após algumas corridas cosecutivas ocorria a deformação os picos de absorvâcia e etupimeto do capilar. Isso acotecia, provavelmete, pela alta cocetração do surfactate CTAB. Não foi possível reduzir a cocetração de CTAB as soluções do aalito, já que o mesmo é essecial para a completa dissolução. Etão, com o objetivo de melhorar a resolução dos picos e solucioar os problemas quato ao etupimeto do capilar, optou-se por reduzir a cocetração de CTAB o eletrólito de corrida. Estudou-se o efeito da cocetração do surfactate uma faixa etre 7,3 e 5,5 g.l -1, faixa de cocetração acima da CMC, cujo valor de referêcia em água é 0,34 g.l -1 (Frazier et al., 000). Utilizado-se a cocetração de 18, g.l -1 de CTAB o eletrólito de corrida obteve-se a melhor resolução dos picos (Figura 13) com tempo de aálise de cerca de 7 mi. Esta

5 Absorvâcia (mau) 105 cocetração do surfactate também miimizou o etupimeto do capilar, possibilitado a realização de um maior úmero de corridas com um mesmo capilar, sem iterrupção para codicioametos Tempo de migração (mi) Figura 13: Eletroferograma das vitamias K3 (pico 1) e K1 (pico ) em uma mistura padrão (K1: 1,8 x 10-1 g.l -1, K3: 6,9 x 10 - g.l -1 ). Eletrólito de corrida: 18, g.l -1 de CTAB, tampão borato 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, V = 5 kv, T = 5 ºC e detecção em 48 m Parâmetros istrumetais Estudos para otimização de parâmetros istrumetais como temperatura, difereça de potecial aplicado e tempo de ijeção da amostra também foram realizados. A temperatura é um parâmetro que deve ser matido costate durate as aálises, pois um aumeto a temperatura pode levar à redução da viscosidade do tampão, aumetado assim a velocidade do EOF e das micelas. Isso provoca uma redução dos tempos de migração dos picos, podedo afetar a resolução, com o alargameto das zoas, e alterar a simetria dos picos. Em testes prelimiares utilizado somete a vitamia K3, com objetivo de verificar a ifluêcia da temperatura, observou-se ão haver difereça sigificativa a largura e simetria do pico e o tempo de migração, para a faixa etre 5 C e 35 C (Figura 14). Assumido-se que o mesmo comportameto ocorreria para a vitamia K1, escolheu-se a temperatura de 5 C para a cotiuidade dos testes.

6 Absorvâcia (mau) d 30 c 0 b Tempo de migração (mi) a Figura 14: Eletroferogramas da vitamia K3 (6,9 x 10 - g.l -1 ) para diferetes temperaturas: (a) 5 C, (b) 7,5 C, (c) 30 C, (d) 35 C. Eletrólito de corrida: 18, g.l -1 de CTAB, tampão borato 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, V= 5 kv e detecção em 48 m. Em relação ao valor da difereça de potecial aplicada, foram realizados testes utilizado dois valores: 5 e 30 kv. Como a força do campo elétrico é diretamete proporcioal à difereça de potecial aplicada (Equação ) e a magitude do EOF é diretamete proporcioal à força do campo elétrico, o aumeto do potecial aplicado levaria à redução do tempo de migração. No etato o aumeto do EOF pode levar a redução da resolução etre os picos devido à dimiuição da jaela de detecção. Os resultados do teste realizado estão apresetados a Figura 15, ode se pode observar que o aumeto da voltagem provocou a dimiuição do tempo de migração das vitamias, com ehum impacto a resolução dos picos de absorvâcia correspodetes. Logo o potecial de 30 kv foi selecioado para a cotiuidade dos testes.

7 Absorvâcia (mau) b a Tempo de migração (mi) Figura 15: Eletroferograma das vitamias K3: 6,9 x 10 - g.l -1 (pico 1) e K1: 1,8 x 10-1 g.l -1 (pico ) para duas difereças de potecial elétrico aplicadas: (a) 5 kv, (b) 30 kv. Eletrólito de corrida: 18, g.l -1 de CTAB, tampão borato 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, T= 5 C e detecção em 48 m. Cosiderado o fato de que as variações a temperatura e valores da difereça de potecial aplicado ão provocaram alteração da área dos picos, resolução e eficiêcia de separação das vitamias K1 e K3 (CV<5%), pode-se afirmar que o método se apreseta robusto em relação a variação de tais parâmetros, podedo os mesmos serem icorporados ao procedimeto. Outro parâmetro istrumetal avaliado foi o volume de ijeção de amostra o capilar. O volume ijetado depede essecialmete do tempo de ijeção. Um aumeto o tempo de ijeção serve muitas vezes para melhorar a sesibilidade do método, pois se aumeta a quatidade de material a ser aalisado. Assim, realizaram-se testes utilizado os tempos de 15, 30, 45 e 75 s de ijeção hidrodiâmica (Figura 16). No etato, foi observado que os tempos maiores que 15 s houve uma sigificate ampliação a largura dos picos, causado a deformação dos mesmos, resultate da alteração da homogeeidade do campo elétrico ao logo do capilar. No tempo de 75 s ão foi possível visualizar os picos das vitamias separadamete devido à deformação dos mesmos. Esse efeito decorre da meor codutividade da solução da amostra, o que provoca um aumeto da impedâcia do sistema o local da ijeção da amostra. Assim sedo utilizou-se o tempo de ijeção de 15 s para a cotiuidade dos testes.

8 Absorvâcia (mau) d c b 0 1 a Tempo de migração (mi) Figura 16: Eletroferograma das vitamias K3: 1,6 x 10-3 g.l -1 (pico 1) e K1: 4,1 x 10-3 g.l -1 (pico ) para diferetes tempos de ijeção: (a) 15 s, (b) 30 s, (c) 45 s e (d) 75 s. Eletrólito de corrida: 18, g.l -1 de CTAB, tampão borato 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar), T= 5 C e detecção em 48 m. Fializada esta etapa de otimização, as codições de trabalho escolhidas são descritas a Tabela 6. Tabela 6: Resumo das codições de trabalho após otimização do método. Parâmetro Tampão Surfactate Modificador orgâico Codição selecioada 3,1 g.l -1 de borato 18, g.l -1 de CTAB 0% v/v de ACN ph 8,5 Potecial 30 kv Temperatura 5 ºC Pressão de ijeção 50 mbar Tempo de ijeção 15 s Tamaho do capilar 60 cm comprimeto total (5 cm até o detector) Diâmetro itero do capilar 75 µm Composição da solução da amostra 10% v/v de ACN 18, g.l -1 de CTAB

9 Codições de codicioameto, pré-codicioameto e limpeza do capilar De modo a se obter uma maior robustez do sistema, com a mauteção da boa repetitividade das respostas aalíticas e o maior úmero de corridas com o mesmo capilar, partiu-se para a otimização de codicioameto, précodicioameto e limpeza do capilar que são realizadas o iício de cada experimeto, etre as corridas e o fial de cada experimeto, respectivamete. As codições escolhidas, após otimização, são apresetadas a Tabela 7. Tabela 7: Codições para o codicioameto, pré-codicioameto e limpeza do capilar. Etapa Codicioameto Précodicioameto Limpeza Codição Selecioada (i) 5 mi de ACN (ii) 15 mi de H O (iii) 10 mi de NaOH (40,0 g.l -1 ) (iv) 10 mi de eletrólito de corrida (i) mi de H O (ii) mi de ACN (iii) mi de H O (iv) mi de NaOH (40,0 g.l -1 ) (v) 5 mi de Tampão Borato (i) 8 mi de H O (ii) 5 mi de ACN (iii) 5 mi de ACN/H O 50/50% v/v A passagem de água durate dois miutos o iício da etapa de précodicioameto foi ecessária para impedir a deposição do CTAB as paredes do capilar, evitado assim o etupimeto dos mesmos durate as aálises. A etapa de limpeza, iicialmete realizada a 5 C, teve sua temperatura alterada para 40 C de modo a remover todo o surfactate utilizado, já que o mesmo se apreseta sólido em temperatura ambiete e quado ão removido totalmete se acumula as paredes do capilar, provocado o etupimeto dos mesmos. A substituição dos vials cotedo a solução eletrolítica foi realizada a cada seis corridas, pois observou-se que durate as aálises a mesma sofria um processo de oxidação, o que é provocado pela alteração da composição química resultate da aplicação sucessiva de potecial elétrico elevado. O tempo total de aálise ficou em toro de 0 mi, já que a etapa de codicioameto (40 mi) é realizada apeas o iício de cada dia de trabalho e

10 110 a etapa de limpeza (18 mi) o fim de cada dia. Sedo realizado apeas a etapa de pré-codicioameto etre corridas Tempo de migração, simetria e resolução dos picos Os valores médios dos tempos de migração, simetria e resolução dos picos das vitamias K1 e K3, obtidos por MEKC as codições de trabalho são apresetados a Tabela 8. Picos simétricos são obtidos quado a mobilidade dos aalitos detro do capilar é próxima à mobilidade do tampão. Os valores de simetria dos picos para as vitamias K1 e K3 ficaram em toro de 1, cosiderado o valor ideal, idicado um bom resultado ao logo das aálises. A resolução etre os picos de absorvâcia foi obtida a partir da Equação 18, a qual utiliza o critério da largura de cada um dos picos à meia altura. 1,176 w ( t 1(1/ ) t w 1 ) (1/ ) R (18) ode: t 1 e t são os tempos de migração dos aalitos 1 e, w 1(1/) e w (1/) são as larguras dos picos 1 e calculadas a meia altura e 1,176 é o fator de multiplicação. A resolução etre os picos das vitamias K1 e K3 foi de 6,0 ± 0,7, valor cosiderado satisfatório já que o valor ótimo é de 1,5 (Neue, 1997). Tabela 8: Valores médios dos tempos de migração, simetria dos picos e resolução etre os picos de vitamia K1 e K3, por MEKC, as codições de trabalho. Aalitos Tempo de migração (mi) Simetria Resolução de liha base K1 5, ± 0,1 1,0 ± 0,1 K3 3,4 ± 0,1 1,1 ± 0,0 6, ± 0,3 6.. Validação do método desevolvido A validação de métodos aalíticos desevolvidos o laboratório é um processo cotíuo que se iicia o plaejameto do método e cotiua durate o desevolvimeto e otimização. Para se garatir a geração de iformações cofiáveis sobre as amostras em aálise, o método aalítico deve ser validado.

11 111 De acordo com a RE º 899, de 9/5/003 da Avisa, métodos aalíticos e bioaalíticos devem ser validados de acordo com os critérios estabelecidos pela mesma. O presete trabalho utilizou como base para a validação do método desevolvido além desta resolução o documeto do Imetro DOC-CGCRE- 008:011 (documeto orietativo sobre validação de métodos aalíticos), bem como o documeto sobre validação de métodos de aálise da IUPAC (IUPAC, 010). A validação da metodologia aalítica foi realizada empregado-se as codições descritas a Tabela 8 (item ) Parâmetros da validação do método aalítico Para validar o método aalítico desevolvido foram avaliados os parâmetros seletividade, liearidade da resposta aalítica, limite de detecção, limite de quatificação, exatidão e precisão Seletividade A seletividade do método foi verificada a partir da aálise de amostras de suplemeto vitamíico, as quais cotiham diversas vitamias e mierais, além da vitamia K1. As amostras foram fortificadas com a vitamia K3 para a realização das aálises. Em seguida compararam-se os resultados obtidos utilizado-se soluções padrões de vitamias K1 e K3, de modo a cofirmar a seletividade. A Figura 17 apreseta o eletroferograma das soluções de vitamias K1 e K3 do suplemeto vitamíico cotedo a vitamia K1 e fortificado com a vitamia K3. A Figura 18 apreseta a sobreposição dos eletroferogramas obtidos através da aálise das amostras de suplemeto vitamíico e da solução padrão.

12 Absorvâcia (mau) Absorvâcia (mau) ,5 K3 K1-1,0-1,5 -,0 -, Tempo de migração (mi) Figura 17: Eletroferograma do suplemeto vitamíico cotedo vitamia K1 (4,1 x 10-3 g.l -1 ) e fortificado com a vitamia K3 (1,5 x 10-3 g.l -1 ). Eletrólito de corrida: 18, g.l -1 de CTAB, tampão borato 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, V= 30 kv, T= 5 C e detecção em 48 m. 0-0,5-1 K3 K1-1,5 Suplemeto vitamíico - -,5 Padrão K1 + K Tempo de migração (mi) Figura 18: Eletroferograma do suplemeto vitamíico e solução padrão de vitamia K1 + K3, cotedo vitamia K1 a cocetração de 4,1 x 10-3 g.l -1 e vitamia K3 a cocetração de 1,5 x 10-3 g.l -1. Eletrólito de corrida: 18, g.l -1 de CTAB, tampão borato 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, V= 30 kv, T= 5 C e detecção em 48 m. A partir do eletroferograma apresetado a Figura 17, pode-se afirmar que o método apreseta boa seletividade para as vitamias K1 e K3, já que ão há

13 113 picos iterferetes próximos aos picos das mesmas. A seletividade pode aida ser comprovada a partir da média do percetual de recuperação e respectivo coeficiete de variação apresetados o item As recuperações foram obtidas por meio de soluções padrões fortificadas com as vitamias K1 e K3. A preseça de outras vitamias e mierais ão iflueciou a separação, o tempo de migração dos aalitos, bem como a área dos picos (Figura 18) Liearidade da resposta aalítica Os parâmetros da curva de calibração podem ser obtidos pela regressão liear simples usado o método dos míimos quadrados, quado a variâcia é homogêea ao logo dos potos amostrados, isto é, quado existe homoscedasticidade. Segudo o documeto DOQ-CGCRE-008, a liearidade da resposta aalítica de um método deve ser avaliada por meio do coeficiete de correlação liear (Imetro, 011). Etretato, o mesmo documeto também destaca que é ecessário avaliar a homogeeidade das variáveis. Isso pode ser feito por meio de algus testes estatísticos (teste t de Studet, a prova F de Fischer, etre outros). De acordo com a IUPAC a avaliação da liearidade deve ser feita a partir da costrução de uma curva aalítica com íveis de cocetração igualmete espaçados etre si, a faixa de cocetração de iteresse, e abrager a faixa de 0 a 150% do valor esperado. Os padrões aalíticos devem ser aalisados o míimo em duplicata, e em ordem aleatória (IUPAC, 010). A avaliação da liearidade foi realizada através de esaios com soluções padrão. Costruíu-se três curvas aalíticas, utilizado-se sete potos cada, sedo cada poto da curva o resultado médio de três medições com respectivos desvios. A faixa liear obtida cobriu as cocetrações de aalito etre 9,0 x 10-4 a 4,5 x 10 - g.l -1 para a vitamia K1, e 3,4 x 10-4 a 1,7 x 10 - g.l -1 para a vitamia K3. A Figura 19 e a Figura 0 apresetam, respectivamete, uma das curvas aalíticas costruídas para as vitamias K1 e K3. A icliação, itercessão e o coeficiete de correlação das curvas aalíticas das vitamias K1 e K3 ecotram-se a Tabela 9 e Tabela 10.

14 Área (u.a) Área (u.a) ,0 1,0x10 -,0x10-3,0x10-4,0x10-5,0x10 - Cocetração de vitamia K1 (g.l -1 ) Figura 19: Curva aalítica para a vitamia K1 as seguites codições: Eletrólito de corrida: 18, g.l -1 de CTAB, tampão borato 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, T= 5 C, V= 30 kv e detecção em 48 m ,0 4,0x10-3 8,0x10-3 1,x10-1,6x10 -,0x10 - Cocetração de vitamia K3 (g.l -1 ) Figura 0: Curva aalítica para a vitamia K3 as seguites codições: Eletrólito de corrida: 18, g.l -1 de CTAB, tampão borato 3,1 g.l -1, ph = 8,5, 0% v/v de acetoitrila, capilar de 60 cm x 75 µm d.i., ijeção por pressão (50 mbar) por 15 s, T= 5 C, V= 30 kv e detecção em 48 m.

15 115 Tabela 9: Parâmetros das curvas aalíticas para a vitamia K1 Parâmetros Curva 1 Curva Curva 3 Icliação,8 x 10 3,8 x 10 3,9 x 10 3 Iterseção 1,0-1, -3,8 r 0,99 1,0 1,0 Tabela 10: Parâmetros das curvas aalíticas para a vitamia K3 Parâmetros Curva 1 Curva Curva 3 Icliação 5, x ,4 x ,5 x 10 3 Iterseção 0,6 0,3 0, r 0,99 1,0 1,0 Utilizou-se o teste de Grubbs para tratameto dos valores aberrates. O método dos míimos quadrados parte do pressuposto que os resíduos seguem uma distribuição ormal, têm variâcia costate ao logo do eixo x e são idepedetes, ou seja, ão há auto-correlação dos resíduos. Deste modo as premissas relativas à aálise da regressão verificadas foram: ormalidade (Rya & Joier, 1976), homoscedasticidade (Levee, 1960; Brow & Forsythe, 1974) e idepedêcia dos resíduos da regressão (Durbi & Watso, 1951). Para verificar o ajuste ao modelo liear utilizou-se o teste F (Draper & Smith, 1998). O teste de Grubbs é primeiramete realizado de modo a verificar a existêcia de um valor disperso em cada extremidade do cojuto. Se esta primeira aálise, um dos dois valores for cosiderado disperso, ele é rejeitado, retirado do cojuto e ovo teste, verificado a existêcia de um valor disperso em cada extremidade do cojuto, é realizado e assim sucessivamete, caso cotrário, se esta primeira aálise, ambos os valores forem aceitos como ão dispersos, o teste é etão realizado verificado-se a existêcia de dois valores dispersos em cada extremidade do cojuto. Se esta seguda aálise os dois resultados de uma das extremidades forem cosiderados como dispersos, eles devem ser rejeitados, retirados do cojuto e ovo teste verificado a existêcia de dois valores dispersos em cada extremidade do cojuto é realizado e assim sucessivamete (Leão, 007). Este teste se utiliza da seguite estatística: G calc xi xmédio (19) s Ode: x i - valor suspeito de ser aberrate;

16 116 x médio - média; s - desvio padrão amostral. Esta estatística testa as seguites hipóteses: H 0 : x i é uma observação cosiderada como valor extremo; H 1 : x i ão é uma observação cosiderada como valor extremo. Rejeita-se a hipótese H 0 com ível de sigificâcia de α, se G > Gc, sedo Gc um valor crítico baseado a distribuição Z, o qual se ecotra tabelado para algus valores de α (Aexo VII). O teste de Rya-Joier, faz uso do teste de hipóteses de modo a cofirmar se os resíduos seguem a distribuição ormal e, portato, os desvios da ormalidade ão seriam sigificativos (Bomfim, 008). A estatística do teste é o coeficiete de correlação de Rya-Joier. Rejeita-se a hipótese ula quado os coeficietes R são iferiores aos valores críticos estabelecidos. Costruiu-se um gráfico dos resíduos ordeados de uma amostra (e i ) de tamaho versus os potos dos percetis de uma distribuição ormal reduzida (q i ). Os quatis ormais foram obtidos pela Equação 0. 1 i 3/8 q i, i 1,..., (0) 1/ 4 Sedo: q i = valor ormal esperado; -1 = iverso de uma fução de distribuição ormal padrão. O coeficiete de correlação etre e i e q i foi obtido a partir da Equação 1: R eq Seq (1) S S ee qq Sedo: s eq eiqi eiqi i1 e eq q i i i i i () s ee ei 1 i1 i i ei e 1 e i (3) s qi 1 qq i1 i i qi q 1 q i (4)

17 117 i e i e 1 (5) qi i q 1 (6) Os dados seguem uma distribuição ormal caso o gráfico seja uma liha reta. Caso cotrário, o gráfico apresetará algum grau de curvatura ou distribuição aleatória de dados, sedo os mesmos proveietes de outra distribuição de probabilidade. A partir da Equação 7 obtiveram-se os coeficietes de correlação críticos para cojuto de dados pertecetes à distribuição ormal para o ível de sigificâcia de 0,05 (Rya & Joier, 1976). O coeficiete R é utilizado para cofirmar o resultado gráfico. R crit 0,188 0,6118 1,3505 1,0063 (7) A homogeeidade das variâcias foi avaliada pelo teste de Levee (Levee, 1960) modificado por Brow e Forsythe (1974), ode se testou a hipótese ula de que as variâcias dos resíduos da regressão ão diferem etre si, ou seja, há homoscedasticidade. A hipótese alterativa foi a de que as variâcias dos resíduos seriam diferetes, ou seja, há heteroscedasticidade. A estatística do teste é o F de Levee (F L ). Dividiram-se os resíduos em dois grupos 1 e, para 1 grau de liberdade, em que t = F, e calculou-se a estatística t de Levee t L. Rejeita-se a hipótese ula se t L for superior ao t crítico t (1-α/; 1+-). Distribuíram-se etão os grupos equitativamete, ão separado repetições de um mesmo ível em grupos distitos. Calculou-se as mediaas dos resíduos de cada grupo ẽ 1 e ẽ e obteve-se as difereças absolutas etre as mediaas e os resíduos (e kj ) dos respectivos grupos. A média das difereças d k e a soma dos quadrados dos desvios SQD k dos valores d kj de cada grupo k = 1 e k = foram calculadas. O valor de t L foi obtido pela Equação 8: t d d 1 L (8) 1 1 s 1 p

18 118 Sedo: d k e~ e kj k (9) d k= média dos módulos das difereças etre o j-ésimo resíduo e a mediaa de cada grupo k = 1 e k = ; k = úmero de observações em cada grupo; e k = mediaa de cada grupo. SQD1 SQD s p (30) 1 SQD k k e ~ k ekj j1 (31) s p = variâcia combiada; SQD k = soma dos quadrados dos desvios etre cada j-ésimo resíduo e a mediaa de seu k-ésimo grupo, para cada grupo. Se t L for iferior ao valor crítico t (1-α/; 1+-), ão há razões para rejeitar a hipótese ula, logo aceita-se que a variâcia dos resíduos seja costate ou seja há homoscedasticidade. A sigificâcia p também deve ser superior a 0,05 (Levee, 1960; Brow & Forsythe, 1974). A idepedêcia dos resíduos da regressão foi avaliada pelo teste de Durbi-Watso, o qual cosidera como hipótese ula há ão autocorrelação etre os resíduos, ou seja, a idepedêcia etre os resíduos; a hipótese alterativa é a de que há autocorrelação etre os resíduos, ão sedo portato, idepedetes. Assumido-se que os resíduos e i são variáveis idepedetes, a autocorrelação etre os resíduos seria ρ s = 0 (hipótese ula). Sedo a hipótese alterativa ρ s = ρ (ρ 0 e ρ < 1). Utiliza-se a estatística de Durbi-Watso para a avaliação (Equação 3).

19 119 d i e e i i1 e i i1 (3) Existem dois limites críticos d L (iferior) e d U (superior) para cada grupo de dados. O teste é icoclusivo quado o valor de d se ecotra etre esses limites. Há idicação de autocorrelação quado se obtém valores de d < d L, este caso rejeita-se a hipótese ula para um ível de sigificâcia de α; já valores de d > d U idicam idepedêcia e a ão rejeição da hipótese ula. O valor de d varia de zero a quatro, se o mesmo coverge para dois sigifica que ão há autocorrelação e os resíduos são idepedetes. Se os valores de d se afastam de dois para zero ou quatro a autocorrelação aumeta. Pode-se utilizar como potos de corte iferior e superior valores etre 1,5 e,5 (Durbi & Watso, 1951). Os valores limites de d são estimados pelas Equações 33 e 34 para ível de sigificâcia igual a 0,05 (Bomfim, 008). d L,8607 3, ,6400 1,9693 (33) d U 3,0547 1,386 16,366 1,983 (34) A Tabela 11 apreseta as equações utilizadas para aálise de variâcia do teste de sigificâcia da regressão. A estatística do teste é a razão etre as variâcias, que segue a distribuição de F com os graus de liberdades correspodetes.

20 10 Tabela 11: Aálise de variâcia para sigificâcia da regressão e desvio de liearidade (α=0,05). FV GL SQ QM F Regressão 1 Resíduos - xi x yi y i1 xi x i1 y i yˆ i i1 SQ GL SQ GL regr regr regr regr s res QM s regr res Desvio da liearidade u - u k k k 1 yˆ y k SQ GL desv desv QM QM desv Erropuro Etre íveis u - 1 u k 1 k y y k Erro puro - u u k ykj yk k 1 j1 SQ GL Erropuro Erropuro Total -1 y i y i i1 SQ GL Total Total Sedo: FV = fote de variação; GL = graus de liberdade; SQ = soma dos quadrados; QM = quadrado médio; F = razão etre variâcias; = úmero de i potos de curva aalítica; u = úmero de íveis de cocetração; k =úmero de potos j em cada ível de cocetração k; y i = resposta medida; x i = cocetração cohecida do aalito; ŷ i = variável depedete estimada pela equação de regressão; y = média das respostas medidas; x = média das cocetrações cohecidas; y kj = j-ésima resposta medida do k-ésimo ível de cocetração; y k =média de respostas medidas do k-ésimo ível de cocetração;

21 Resíduos Resíduos 11 ŷ k = variável depedete estimada pela equação de regressão para o k-ésimo ível de cocetração. Para avaliação da regressão, testa-se a hipótese ula de que a regressão liear ão é sigificativa (variação dos valores de y i ão é explicada pela regressão) e a hipótese alterativa de que a regressão liear é sigificativa (variação dos valores de y i é explicada pela regressão). Rejeita-se a hipótese ula se o valor de F for maior que o valor crítico F (1-α;1;-). Em relação à sigificâcia do desvio da liearidade, cofrota-se a hipótese ula de adequação ao modelo liear simples (ão há desvio da liearidade) com a hipótese alterativa de iadequação ao modelo liear (há desvio da liearidade). A hipótese ula é rejeitada quado o valor de F for maior que o valor crítico F (1- α;u-;-). Outra aálise a ser realizada se refere à sigificâcia da distribuição F (p). Para a regressão liear dos resíduos, p deve ser iferior a 0,001, já para o desvio da liearidade, p deve ser superior a 0,05 (Bomfim, 008). O teste de Grubbs aplicado a cada ível de cocetração aalisado ão revelou a preseça de valores aberrates. O gráfico dos resíduos em toro da média (zero) é apresetado a Figura 1 e ,01 0,0 0,03 0,04 0,05 Cocetração de vitamia K1 (g.l -1 ) Figura 1: Gráfico de resíduos da curva aalítica para a vitamia K ,005 0,01 0,015 0,0 Cocetração de vitamia K3 (g.l -1 ) Figura : Gráfico de resíduos da curva aalítica para a vitamia K3.

22 1 O teste de ormalidade dos resíduos demostrou que os dados, tato para a vitamia K1 quato para a vitamia K3, seguem uma distribuição ormal, já que o coeficiete de correlação Rya-Joier calculado foi superior ao valor crítico estabelecido (Tabela 1). Logo, se aceita a hipótese ula de que os dados seguem a distribuição ormal. A aálise da homogeeidade das variâcias dos resíduos realizada pelo teste de Levee adaptado por Brow-Forsythe, demostrou que as variâcias dos resíduos da regressão são costates (Tabela 1). As estatísticas de aálise são os valores de t L e a sigificâcia p. Tato para a vitamia K1 quato para a vitamia K3 o valor de t L calculado foi iferior ao tabelado e a sigificâcia p calculada superior a 0,05, logo coclui-se que há homogeeidade das variâcias dos resíduos. A aálise da autocorrelação dos resíduos da regressão foi realizada por meio do teste de Durbi-Watso, o valor de d obtido foi superior aos valores críticos tato para a vitamia K1 quato para a vitamia K3 (Tabela 1), demostrado a idepedêcia dos resíduos da regressão. O ajuste ao modelo liear e a sigificâcia da regressão foi verificado por meio da ANOVA. A aálise demostrou regressões sigificativas (p < 0,001) e o ajuste ao modelo liear (p > 0,05) tato para a vitamia K1 quato para a vitamia K3. A Tabela 1 apreseta os resultados obtidos a partir da avaliação das premissas relativas à liearidade.

23 13 Tabela 1: Aálise das premissas relativas à liearidade. Parâmetros K1 K3 Normalidade dos Resíduos R eq 0,95 0,95 R crit (α=0,05) 0,95 0,95 Autocorrelação dos Resíduos d (calculado), 1,44 d L (Limite iferior) α=0,05 1, 1, d U (Limite superior) α=0,05 1,4 1,4 Homogeeidade da Variâcia dos Resíduos t Lcalculado 1,63 1,56 t tabelado (α=0,05),09,09 p 0,1 0,14 Aálise da Variâcia (ANOVA) Regressão (p) 8,75 x ,55 x 10-5 Desvio da liearidade (p) 0,19 0,4 Para ambas as vitamias, as curvas aalíticas apresetaram comportameto liear, o qual é demostrado pelos resultados do coeficiete de correlação (r) maior que 0,99 (Avisa, 003a). O bom ajuste ao modelo liear foi verificado pela distribuição aleatória o gráfico dos resíduos em toro da média (zero) apresetada a Figura 1 e a Figura Limite de detecção e de quatificação O limite de detecção (LOD), obtido por meio da aálise de sete soluções cotedo a meor cocetração dos aalitos que se cosegue visualmete observar o eletroferograma, foi calculado por meio da Equação 35 (Imetro, 011). O método de obteção do s, a partir das soluções cotedo as meores cocetrações dos aalitos foi adotado devido à dificuldade de medição de um sial de braco (o sial do braco é praticamete zero). LOD x b 3s (35) ode x b é a média dos valores medidos para os bracos e s é o desvio padrão das sete medições da meor cocetração do aalito.

24 14 O limite de quatificação (LOQ) foi realizado de modo semelhate à determiação do LOD, utilizado-se, o etato a Equação 36. LOQ x b 10s (36) O cálculo de LOD e de LOQ também pode ser realizado com a cela de camiho óptico alogado (camiho óptico de 100 µm). O uso da cela teve como objetivo aumetar em 16 vezes o camiho óptico quado comparado com a medição tradicioal perpedicular ao capilar de 75 µm. Com isso, é possível melhorar os limites de detecção e de quatificação em uma ordem de gradeza. Para efeito de comparação a Tabela 13 estão apresetados os valores de LOD e LOQ com a cela tradicioal e a cela de camiho óptico alogado, bem como valores de LOD e LOQ obtidos por outros métodos, por exemplo, os baseados em cromatografia gasosa (Reto et al., 007) e em HPLC (Ma Po et al., 1996; Petritz et al., 005; Kiee et al., 007; Orsi et al., 008). Tabela 13: Limites de detecção e quatificação para as vitamias K1 e K3, com a cela tradicioal e a cela de camiho óptico alogado e valores de LOD e LOQ de métodos de referêcia. Método Aalito LOD (g.l -1 ) LOQ (g.l -1 ) Presete trabalho (cela tradicioal) Presete trabalho (cela de camiho óptico alogado) MEKC MEKC K1 1,8 x 10-3,4 x 10-3 K3 4,3 x ,8 x 10-4 K1 1,5 x ,6 x 10-4 K3 1,0 x ,4 x 10-5 Reto et al., 007 GC K1 1,6 x ,4 x 10-4 Kiee et al., 007 HPLC K1 8,3 x 10-4,5 x 10-3 Ma Po et al., 1996 HPLC K1,5 x K3,0 x Petritz et al., 005 HPLC K1 5,0 x Orsi et al., 008 (método de referêcia) HPLC K1 5,0 x ,3 x 10 - K3 1,0 x 10-3,5 x 10-3 A partir da aálise dos resultados observa-se que o uso da cela possibilitou uma melhora tato do LOD quato do LOQ para ambas as vitamias em cerca

25 15 de uma ordem de gradeza. Os resultados foram cosiderados satisfatórios, já que a detectabilidade do método proposto após utilização da cela de camiho óptico alogado se ecotra a mesma ordem de gradeza de outros métodos descritos a literatura como idicado a Tabela Exatidão A exatidão do método foi avaliada por meio de testes de recuperação realizados aplicado-se o método desevolvido em amostras de chá (ifusões fortificadas com vitamia K1) e em amostras de suplemeto vitamíico cotedo a vitamia K1 e fortificadas com a vitamia K3. O procedimeto para cada uma das amostras foi feito coforme procedimeto descrito o Capítulo 5. O cálculo para obteção da recuperação aalítica foi realizado coforme Equação 37 (Imetro, 011). Os resultados médios de recuperação cosiderados adequados são estabelecidos em fução da cocetração do aalito (Tabela 14) (Brito et al. 003). Na Tabela 14 se destaca, em egrito, a faixa relativa à cocetração dos aalitos as amostras aalisadas esse trabalho. valorobservado Recuperação (%) 100 (37) valor esperado Tabela 14: Recuperação do aalito em fução da cocetração Cocetração do aalito Itervalo de recuperação aceito, % 10 % % ,1 % ,01% ,001 0, , , Na Tabela 15 são apresetados os resultados de recuperação obtidos para as medições de vitamias K1 e K3 as amostras de suplemeto vitamíico e chá, utilizado o método proposto o presete trabalho.

26 16 Tabela 15: Coeficietes de recuperação obtidos a aálise de amostras de suplemeto vitamíico e chá utilizado o método proposto. Amostras Aalitos Suplemeto Vitamíico (=3) Chá (=3) Vitamia K1 101 ± % 103 ± % Vitamia K3 99 ± 3% - Os coeficietes de recuperação obtidos estão equadrados os limites (etre 95 e 105%) descritos a literatura (Brito et al. 003), já que a cocetração do aalito a solução fial das amostras aalisadas foi de 4,1 x 10-3 g.l -1 para a vitamia K1 e 1,5 x 10-3 g.l -1 para a vitamia K3, ambas maiores que 0,1%. Para avaliar a exatidão, também foi realizada comparação dos resultados obtidos com o método proposto por MEKC e os obtidos com o método de referêcia, baseado em HPLC (Orsi et al., 008). Realizou-se a costrução de curvas aalíticas para ambos os métodos utilizado-se soluções padrão em diferetes cocetrações, detro da faixa de trabalho do método proposto. Em seguida foram feitas as medições em replicatas autêticas, comparado os resultados obtidos por meio do teste de hipótese (teste t de studet). Os resultados (Tabela 16 e 17) mostraram que ão houve difereça sigificativa para o ível de 95% de cofiaça etre os métodos. Tabela 16: Resultados ecotrados etre o método proposto (MEKC) e o método HPLC de referêcia para a aálise de solução padrão de vitamia K1. K1: 4,0 x 10-3 g.l -1 K1:,3 x 10 - g.l -1 N de replicatas () MEKC (g.l -1 ) HPLC (g.l -1 ) MEKC (g.l -1 ) HPLC (g.l -1 ) 1 3,8 x ,8 x 10-3,3 x 10 -,3 x 10-3,9 x ,8 x 10-3,3 x 10 -,3 x ,7 x ,7 x 10-3,3 x 10 -,3 x ,7 x ,7 x 10-3,3 x 10 -,3 x ,0 x ,8 x 10-3,3 x 10 -,3 x 10 - x 3,8 x ,8 x 10-3,3 x 10 -,3 x 10 - s 1,1 x ,6 x ,9 x ,9 x t calc. t tab. 1,4,8 0,7,6

27 17 Tabela 17: Resultados ecotrados etre o método proposto (MEKC) e o método HPLC de referêcia para a aálise de solução padrão de vitamia K3. N de replicatas () MEKC (g.l -1 ) HPLC (g.l -1 ) MEKC (g.l -1 ) HPLC (g.l -1 ) 1 1,5 x ,5 x ,6 x ,8 x ,5 x ,5 x ,0 x ,8 x ,5 x ,5 x ,7 x ,8 x ,5 x ,5 x ,7 x ,8 x ,5 x ,5 x ,4 x ,8 x 10-3 x 1,5 x ,5 x ,7 x ,8 x 10-3 s 3, x ,9 x 10-6,4 x ,8 x t calc. t tab. K3: 1,5 x 10-3 g.l -1 0,4 K3: 8,6 x 10-3 g.l -1 1,0,8, Precisão A precisão do método foi avaliada em termos da repetitividade e da precisão itermediária. A repetitividade foi calculada pelo desvio padrão relativo (%CV) idicado a Equação 38. Foram avaliados três íveis de cocetração ao logo da faixa de trabalho (poto acima do LQ, poto médio da curva, poto superior da curva), sedo que para cada ível foram realizadas cico replicatas (Imetro, 011; Avisa, 003a). sr CV (%) RSD 100 (38) M medição ode s r é a estimativa do desvio padrão, M medição é a média das determiações. A avaliação da repetitividade foi realizada a partir do valor de Horrat, o qual pode ser obtido a partir do RSD R, que correspode ao desvio padrão relativo sob codições de reprodutibilidade. A fução de Horwitz é uma equação de precisão geeralizada idepedete do aalito e da matriz, sedo depedete apeas da cocetração para a maioria dos métodos de aálise de rotia, sedo dada pela Equação 39 (Imetro, 011; UE, 00). RSD R (10,5log C) (39)

28 18 ode C é a fração em massa do compoete aalisado. Em codições de repetitividade o valor de HorRat (Equação 40) pode ser obtido a partir do CV(%) dividido pelo RSD r estimado, o qual está etre 1/ a /3 de RSD R. CV (%) HorRat (40) 3 RSD R Para a vitamia K1 os valores de repetitividade ficaram etre 1 a %, já para a vitamia K3 obtiveram-se valores etre a 7%. Segudo o documeto regulatório da Avisa, Resolução - RE º 899, de 9 de maio de 003, ão se admitem valores superiores a 5% para o CV(%), o etato os valores de Horrat (Tabela 18) obtidos em todos os íveis de cocetração avaliados foram meores do que 1, o que idica que a metodologia pode ser cosiderada repetitiva, já que, segudo Horwitz e Albert (006), valores de Horrat meores ou iguais a idicam que o método apreseta repetitividade adequada (Horwitz & Albert, 006). Tabela 18: Avaliação da repetitividade para cada ível de cocetração K1 K3 Cocetração g.l -1 Valor calculado (Horrat),3 x ,,3 x 10-0,1 4,5 x 10-0, 8,6 x ,6 8,6 x ,3 1,7 x 10-0,3 A precisão itermediária foi calculada a partir de experimetos realizados em dois dias diferetes. Aalisou-se a mesma solução padrão em três íveis de cocetração ao logo da faixa de trabalho (poto acima do LQ, poto médio da curva, poto superior da curva), sedo que para cada ível foram realizados cico replicatas, em um itervalo de 4 h. O coeficiete de variação pode ser obtido a partir do desvio padrão da precisão itermediária (Equação 41) e da média das medições dos dois dias (Imetro, 011; Bomfim, 008). Spi t y jk y t( 1) j1 k1 ( jk ) (41)

29 19 Ode: t = total de amostras esaiadas; = total de esaios efetuados por amostra; j = º da amostra, j = 1, t; k = º do esaio da amostra j, k = 1, ; y jk = valor do resultado k para a amostra j; y j = represeta a média aritmética dos resultados da amostra j. No etato, como foram efetuados esaios em dois dias diferetes (=), utilizou-se a Equação 4. Spi ( jk) 1. t j1 ( y j1 y j (4) t ) Ode: y j1 = resultado médio obtido para a amostra j o primeiro dia; y j = resultado médio obtido para a amostra j o segudo dia. Utilizou-se o teste F baseado o pricípio da ANOVA, de modo a verificar se existe difereça sigificativa etre as variâcias das aálises obtidas em dois diferetes dias. O valor de F é obtido a partir da Equação 43 (Skoog et al., 005): MQF F (43) MQE sedo, MQF a soma das médias quadráticas etre dias e MQE a soma das médias quadráticas de cada dia. A partir dos valores de F ecotrados (Tabelas 19 e 0) pode-se afirmar que ão há difereça sigificativa etre as variâcias das aálises realizadas em dois dias diferetes, já que F cal < F critico para todos os íveis. Comparou-se também a média dos resultados obtidos a partir do estudo da precisão itermediária através do teste t, e os mesmos idicaram ão haver difereça sigificativa etre as médias das aálises realizadas em dois dias diferetes. A Tabela 19 e a Tabela 0 apresetam os dados obtidos o estudo de precisão para as vitamias K1 e K3, respectivamete.

30 130 Tabela 19: Precisão (repetitividade e precisão itermediária) para a vitamia K1. Níveis Repetitividade (%) Precisão itermediária (%) F calc. F crítico T calc. T crítico 1 1,6,7 1,5-1, 0,6 1,3 1,7 5,3 1,3,3 3 1,3 4,6 4,3 -,1 Níveis: 1 =,5 x 10-3 g.l -1 ; =,5 x 10 - g.l -1 ; 3 = 4,51 x 10 - g.l -1. Tabela 0: Precisão (repetitividade e precisão itermediária) para a vitamia K3. Níveis Repetitividade (%) Precisão itermediária (%) F calc. F crítico T calc. T crítico 1 6,7,5 0,3 0,5,7 1,5, 5,3 0,0,3 3 1,8 7,1,5-1,6 Níveis: 1 = 8,61 x 10-4 g.l -1 ; = 8,61 x 10-3 g.l -1 ; 3 = 1,7 x 10 - g.l -1. A precisão itermediária obtida pode ser cosiderada adequada, já que de acordo com Wood (1999) são aceitos RSD de até 8%, a faixa de cocetração de 10 - a 10-4 g.l Icerteza de Medição A icerteza associada ao método desevolvido foi estimada coforme descrito o item 4.3, com base o Guia para a expressão da icerteza de medição (JCGM 100:008). As compoetes relevates foram agrupadas em quatro grupos pricipais: (i) Preparo de soluções críticas, (ii) Repetitividade, (iii) Precisão itermediária, (iv) Curva aalítica. Uma vez estimada a icerteza de cada compoete, calculou-se a icerteza combiada e expadida. A Figura 3 mostra o diagrama de causa e efeito cosiderado a idicação das fotes das icertezas mais relevates para o processo de medição para quatificação de vitamia K por MEKC.

31 131 Preparo de soluções críticas Repetitividade Balão volumétrico (certificado) Volume Micropipeta (certificado) Equipameto ph Fator de diluição Dia Repetições Massa (certificado da balaça) Coeficiete a e b (regressão liear) Variações do equipameto Determiação de vitamias K por EC Precisão itermediária Curva aalítica Figura 3: Diagrama de causa e efeito cosiderado as fotes de icerteza mais relevates para o método de determiação de vitamia K desevolvido. Para o cálculo da icerteza associada ao preparo de soluções críticas (u s ), os parâmetros cosiderados foram: massa do aalito, balão volumétrico, micropipeta e fator de diluição. O cálculo foi realizado coforme Equação 44. u s U k mp1 U k bv U fd U k bal (44) sedo, U mp1 a icerteza da micropipeta de L, U bv a icerteza do balão volumétrico, U fd a icerteza do fator de diluição, U bal a icerteza da balaça e k o fator de abragêcia de cada compoete. A icerteza combiada de cada compoete é dada pela razão etre o valor da icerteza expadida U expressa o certificado de calibração e o fator de abragêcia k. Os certificados referetes às calibrações da balaça, micropipetas e balão volumétrico se ecotram os aexos I, IV, V e VI. A icerteza associada à repetitividade (u r ) foi estimada a partir do desvio padrão s r resultate da aálise em quituplicata de três íveis de cocetração (poto acima do LQ, poto médio da curva, poto superior da curva) de soluções padrões das vitamias K1 e K3. A icerteza associada à precisão itermediária (u pi ) foi obtida do mesmo modo que a icerteza da repetitividade, porém o

32 13 cálculo foi realizado a partir da estimativa do desvio padrão da precisão itermediária s pi. Ambas as icertezas foram obtidas a partir das Equações 38 e 39. Já para a realização do cálculo da icerteza associada à curva aalítica utilizou-se a Equação 45: u curva ci s a ci s b ci ci u u r a b a b a b (45) ode c ia e c ib são coeficietes de sesibilidade, s a e s b são os desvios padrões dos coeficietes agular e liear respectivamete e r é o coeficiete de correlação. Os coeficietes de sesibilidade são usados para uiformizar as uidades das gradezas de etrada em relação à uidade do mesurado e podem ser obtidos a partir das Equações 46 e 47. Ode b é a itercepção da reta e a é a icliação da reta. c ia y maioru. a. (46) a b c ib 1/ a (47) Os desvios padrões e o coeficiete de correlação podem ser obtidos a partir das Equações 48, 49 e 50. s a s C D (48) s D s b (49) C r (50) C sedo C a cocetração do aalito utilizado para a costrução da curva e o úmero de potos. Os valores de s e D correspodem à variâcia e ao desvio da curva respectivamete, sedo dados pelas Equações 51 e 5. C C D (51)

33 133 s (5) ode é a difereça etre o valor teórico de C (C teórico ) o melhor ajuste da curva e o valor experimetal de C (C experimetal ). As icertezas u a e u b são obtidas a partir das Equações 53 e 54. ua s a (53) ub s b (54) A icerteza combiada (u c ), obtida pela raiz quadrada da soma quadrática de todas as cotribuições de icerteza relativas à medição das vitamias K1 e K3, bem como a icerteza expadida e demais icertezas associadas à medição são apresetadas a Tabela 1 e a Tabela. Na Figura 4 e a Figura 5 são apresetados os gráficos de cotribuição referetes a cada fote de icerteza associada. Tabela 1: Valores das icertezas das fotes mais relevates para a vitamia K1. Cocetração K1 (g.l -1 ) Fotes de icerteza,3 x 10-3,3 x 10-4,5 x 10 - Repetitividade (u r ) 4,6 x 10-5,9 x ,6 x 10-3 Precisão itermediária (u pi ) 1,4 x ,1 x10-4 1,3 x10-3 Curva aalítica (u curva ) 4, x , x10-4 4, x10-4 Preparo da solução (u s ) 3,3 x 10-4,4 x 10-4,4 x 10-4 Icerteza Combiada (u c ) 5,4 x 10-4 ( 30%) 5,7 x 10-4 (%), x 10-3 (5%) Icerteza Expadida (U k=; 95% ) 1,1 x , x ,7 x 10-3

34 Fotes de icerteza 134 ucombiada u (curva) us (volume) upi P3 P P1 ur 0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3,0x10-3,5x10-3 Cocetração K1 (g.l -1 ) Figura 4: Cotribuição relativa das fotes de icerteza a icerteza combiada (u c ) da medição de vitamia K1 para as seguites cocetrações: (P1),3 x 10-3 g.l -1, (P),3 x 10 - g.l -1, (P3) 4,5 x 10 - g.l -1. Tabela : Valores das icertezas das fotes mais relevates para a vitamia K3. Cocetração K3 (g.l -1 ) Fotes de icerteza 8,6 x ,6 x ,7 x 10 - Repetitividade (u r ) 6,0 x 10-5,1 x ,1 x 10-3 Precisão itermediária (u pi ),3 x ,3 x10-5 5,9 x10-4 Curva aalítica (u curva ) 1,8 x ,8 x10-4 1,8 x10-4 Preparo da solução (u s ) 1,3 x ,1 x ,3 x 10-5 Icerteza Combiada (u c ),3 x 10-4 ( 6%) 3,1 x 10-4 (3%) 1, x 10-3 (8%) Icerteza Expadida (U k=; 95% ) 4,5 x ,4 x 10-4,9 x 10-3

35 Fotes de icerteza 135 ucombiada u (curva) us (volume) upi P3 P P1 ur 0 3,0x10-4 6,0x10-4 9,0x10-4 1,x10-4 1,5x10-4 Cocetração K3 (g.l -1 ) Figura 5: Cotribuição relativa das fotes de icerteza a icerteza combiada (u c ) da medição de vitamia K3 para as seguites cocetrações: (P1) 8,6 x 10-4 g.l -1, (P) 8,6 x 10-3 g.l -1, (P3) 1,7 x 10 - g.l -1. A partir dos resultados apresetados observa-se que tato para a vitamia K1 quato para a vitamia K3 o poto P1 as fotes que mais cotribuem para a icerteza estão associadas à costrução da curva aalítica e ao preparo das soluções, o que já era esperado, já que o poto aalisado se ecotra próximo ao limite de quatificação, apresetado, portato o maior erro. Uma alterativa para miimizar a icerteza este poto seria fazer o desdobrameto da curva aalítica em duas e realizar o preparo das soluções por meio de ajuste de massa, o que levaria em cota apeas a icerteza da balaça aalítica, miimizado assim o valor de µ s. Já para os potos P e P3, observa-se que tato para a vitamia K1 como para a vitamia K3 coforme se aumeta a cocetração a icerteza associada à repetitividade e a precisão itermediária aumetam, o etato este aumeto é proporcioal ao aumeto da cocetração aalisada das vitamias, possuido uma cotribuição míima a icerteza fial, já que estes potos o valor desta já é baixo.