Biotecnologia: principais me todos moleculares

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1 Biotecnologia: principais me todos moleculares Raphael Bessa Parmigiani, PhD Centro de Oncologia Molecular Instituto Sírio-Libanês de Ensino e Pesquisa Curso de Introdução à Biologia Molecular Goiânia, Maio 2014

2 Manipulação e análise de DNA PCR convencional e em tempo real Microarray CGH Sequenciamento Sanger Sequenciamento Segunda Geração Manipulação e análise de RNA RT-PCR cdna Microarray Sequenciamento Segunda Geração

3 PCR - Polymerase chain reaction Isolamento e Amplificação de uma região específica do genoma É baseado no processo de replicação do DNA Importante para:... Clonagem; Estudos forenses; Estabilidade de microssatélites Sequenciamento Diagnóstico de doenças infecciosas

4 Termociclador Tampão (sais) dntps (A T C G) Taq DNA Polimerase gdna Primers (iniciadores)? Replicação depende de iniciadores! Especificidade para a região que se deseja estudar

5

6 Eletroforese - +

7 PCR em tempo real (Real time PCR)

8

9 Como detectar a amplificação a cada ciclo?

10 Chromosomal alterations as biomarkers Translocation is used for diagnosis and disease monitoring through detection of tumor DNA in the patient blood

11 RT-PCR (Reverse transcription- Polymerase chain reaction) Utilizado para avaliação da expressão gênica. Amostra utilizada é o RNA (mensageiro ou mirna). Geralmente utiliza-se um gene como normalizador entre as diferentes amostras.

12 Oncotype Recurrence Score result is calculated from the gene expression results by Real time PCR low risk (recurrence score, less than 18); intermediate risk (recurrence score, 18 or higher but less than 31); high risk (recurrence score, 31 or higher).

13 Microarray

14 Microarray Microarranjos de DNA: imobilização de milhares de regiões distintas do genoma em uma superfície sólida (de maneira organizada). Técnica em larga escala! Amostra marcada Anelamento específico!

15 Microarray Aplicações Perfil de expressão gênica Detecção de perdas e ganhos de pequenos ou grandes porções do genoma Detecção de SNPs cdna microarray SNP array RNA CGH array DNA

16 CGH: Comparative Genomic Hybridization

17 Visualização dos dados CNV: copy number variation

18 ERBB2 % Extent and pattern of the HER2-amplicon on chromosome 17q12-q21 in HER2+ BC.

19 cdna MICROARRAY A razão da intensidade de fluorescência vermelha/verde de uma sonda indica o nível de expressão relativa de determinado gene nas duas amostras.

20 MAMMAPRINT Análise de expressão por microarray de 70 genes associados com proliferação, invasão e angiogênese. Prediz a chance da paciente (com carcinoma invasivo, estadios 1 ou 2 e linfonodo negativo) em desenvolver metástase a distância classificando-a no grupo de baixo ou alto risco de recorrência. Pacientes no grupo de baixo risco tem sobrevida livre de metástase acima de 90% em 10 anos, sem adição de tratamento adjuvante.

21 SEQUENCIAMENTO DE DNA A metodologia de Sanger foi introduzida por Frederick Sanger em SANGER et al., PNAS 1977

22 O Método de Sanger Método se baseia na utilização de análogos aos dntps, os dideoxinucleotídeos (ddntps). Estas moléculas não possuem o grupamento hidroxila no carbono que ocupa a posição 3 da ribose. dntp ddntp OH H

23 O Método de Sanger

24 O Método de Sanger Cada ddntp é marcado com um fluoróforo diferente. O sinal fluorescente emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda.

25 Next Generation Sequencing (NGS)

26 The power of Next Generation Sequencing

27 Different questions, different applications

28 Genoma completo X Exoma

29 Exoma (conjunto de exons) 1. The genomic DNA sample is fragmented. 2. The sample is hybridized to a custom NimbleGen Sequence Capture array. 3. Unbound fragments are removed. 4. The target-enriched pool is eluted and amplified. 5. The enriched sample is ready for high-throughput sequencing, such as with a 454 GS FLX instrument

30 Reads Captured Capture efficiency Enrichment in the exonic regions 35

31 Reads Captured Zoom in: Exons

32 Aplicações clínicas do NGS Sequenciamento de todo o exoma: busca por genes associados a doenças hereditárias (ou síndromes de câncer hereditário); Sequenciamento de painéis de genes envolvidos com o desenvolvimento do câncer e auxiliar assim na conduta terapêutica.

33 Obrigado!

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