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1 Bruno Matos e Júlia Cougo PCR in situ PCR Hotstart Disciplina de Biologia Molecular Profª. Fabiana Seixas Graduação em Biotecnologia - UFPel

2 PCR in situ

3 - É a técnica de PCR usada diretamente numa lâmina de tecido ou células isoladas. Para essa técnica, é adicionada a Taq Polimerase diretamente na lâmina e realizada uma ciclização diferente, em termocicladores adaptados. - A PCR in situ combina a sensibilidade da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) com a especificidade e versatilidade do imunoensaio.

4 São usadas técnicas de detecção do produto da PCR para análise das amplificações. Um exemplo é a PCR in situ servir para detecção da presença de cargas de DNA em tecidos ou células que se acredite estarem infectadas. Ex: detecção de vírus por PCR in situ (amplificando o DNA do vírus) e posterior identificação do vírus. Para tanto, o DNA procurado já deve ser conhecido.

5 Vantagens: - Possibilidade desconhecidos: de identificação de patógenos Muitas doenças têm desenvolvimento de seus patógenos lento, mas apresentam sintomas. Portanto a PCR in situ é uma saída para a amplificação e identificação de DNA estranho em tecidos e células e conhecimento de que tipo de doença está ocorrendo. - A PCR permite a correlação direta dos resultados com as características histológicas e citológicas da amostra. - A identificação de quantidades ínfimas de DNA, bem como de células que possuam genes específicos.

6 Desvantagens: - O tempo é maior que o da PCR convencional (1 ciclo leva 15 minutos, enquanto o da PCR comum leva 1 minuto). - Não permite a análise molecular do produto da PCR, pois poderia ocorrer degradação do DNA amplificado no momento da extração das células da lâmina (por conta da fixação). - O tempo de espera para o DNA alongar-se é maior, pois há a barreira da própria célula retendo o DNA no meio intracelular.

7 Etapas: 1) Preparação das lâminas Os procedimentos de preparação do tecido ou das células a serem submetidas à PCR in situ diferem de acordo com a origem do tecido e seu estado após a manipulação, mas em geral, tecidos animais passam pelos processos normais de preparação de lâminas (em micrótomo) e tecidos vegetais passam por processos de secagem para irem às lâminas.

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9 Protocolo de preparação de folhas de cana de açúcar: - Corte as folhas em pedaços pequenos (mm máx 5x2). - Fixação em FAA, a 4 C durante 24 h. - Desidratação do tecido duas vezes, durante 30 min em 70% EtOH, seguida de 30 min de EtOH a 100%. - Transferência para Estisol puro duas vezes durante 30 min. - Incorporação dos tecidos em parafina ou paraplast. - Corte de secções de 8-10 μm. - Secagem mínima de 24 h a 40 C. - Retirada da parafina em xileno (ou Histoclear) durante 5 minutos seguido por 5 min em EtOH a 100%. - Secagem à temperatura ambiente.

10 2) Fixação Substâncias que aumentam a aderência do material à lâmina. - Fixadores: - FAA - Paraformaldeído 3) Degradação celular - Pectinase (plantas) - Pepsina (animais)

11 4) Adição dos componentes e da Taq Polimerase: - Para cada lâmina, preparar 25 μl de solução: μl de PCR buffer μl de MgCl2 (25 mm de solução estoque) μl de solução dntp (200 mm concentração final de cada nucleotídeo) μl de albumina de sorobovino 2% (BSA) μl de solução dutp digoxigenina (1 mm solução estoque) - 1 μl de cada um dos primers: primer 1 and primer 2 (20 μm) - 11 μl de água μl de Taq polimerase

12 5) Termociclização e PCR em si 6) Detecção A detecção da amplificação pode ocorrer de duas maneiras diferentes: - Direta: marcadores (ex: Biotina) são incorporados pelo produto da PCR e na seqüência detectados por Imunohistoquímica. - Indireta: hibridização in situ de uma sonda de DNA (radiomarcada ou não) no produto da PCR, também seguida de Imunohistoquímica.

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15 Artigos:

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18 PCR Hot Start

19 Hot Start PCR é uma forma modificada da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), que evita a amplificação não específica de DNA por inativar a Taq polimerase a baixas temperaturas, ou por utilizar uma polimerase especifica que necessita de um meio de ativação.

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21 Vantagens: Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir a temperatura de 94 C. Outro exemplo é o da AmpliTaq Gold, que é uma enzima que atinge sua forma ativa apenas se permanecer 10 minutos em temperatura de 94ºC. Ao mesmo tempo em que as enzimas estão sendo ativadas, o DNA está sofrendo desnaturação, portanto a enzima irá trabalhar em temperatura ideal e no momento correto (aumento da especificidade).

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23 Desvantagens: - Como se trata de um processo manual, há risco de contaminação mais alto. - No caso da compra de enzimas especiais prontas, sejam as conjugadas ou especiais, o processo encarece.

24 Formas de ativação das polimerases: 1 Cápsula de cera: quando degradada permite a ativação enzimática. 2 Degradação do anticorpo conjugado à enzima. 3 Adicionar a enzima em temperatura ideal (risco de contaminação e erro)

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26 A ativação da enzima e a desnaturação do DNA ocorrem na mesma fase, levando a polimerase a trabalhar em temperatura ótima na fase seguinte.

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29 Referências: biotium-polimerases---pcr-hot-start

30 Gratos pela atenção!

31 Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologia Disciplina: Biologia Molecular Profª.: Fabiana Seixas PCR In Situ e Hot Start PCR Camila Caldeira Simões Priscila Silveira dos Santos Pelotas, 30 de janeiro de 2013.

32 PCR

33 PCR In Situ Reação da cadeia polimerase que ocorre dentro da célula, além de poder ser realizado na superfície da lâmina.

34 Variações PCR In Situ RT In Situ PCR PCR Hibridização In Situ

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36 RT- PCR In Situ É a combinação entre a PCR In Situ e a transcrição reversa. Ela difere da PCR In Situ normal em dois passos: na digestão com DNase e na etapa de transcrição reversa.

37 PCR- Hibridização In Situ PCR In Situ 15 ciclos a 94ºC em 1 min. PCR Hibridização In Situ Sondas e 35 ciclos a 94ºC em 1 min.

38 Aplicações Identificação de marcadores celulares; Localização de sequências de células específicas dentro das populações de células; Detectar RNAs que ocorrem em um número de cópias relativamente elevado; É mais indicada para diagnóstico viral.

39 Detecção Protocolo Preparação de cortes de tecidos e amostras de células Digestão protease DNase Digestão (para RT-PCR In Situ) RT PCR

40 Vantagens Permite a localização do sinal amplificado dentro da estrutura do tecido Detectar DNA viral, proviral, rearranjos do DNA e translocações. Pode detectar quantidades pequenas de DNA

41 Desvantagens A barreira física de uma célula fixada aumenta o tempo de alongamento do DNA.

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43 Artigo Objetivo: detecção molecular de uma pandemia de gripe A (H1N1) 2009 cepas é possível no material de arquivo, como parafinizado pulmonares. Métodos: RT-PCR in situ. Resultados: Detectamos 100% de transcritos de neuraminidase das amostras diagnosticados A (H1N1)-positivas. Nenhuma expressão foi detectada em dois paciente (H1N1)-negativas. In situ os níveis de transcrição estão relacionados com os resultados obtidos in vitro realizados com RT-PCR.. Análise da sequência mostrou similaridade de 98% com o vírus da gripe relatados anteriormente em outros lugares. Conclusões: Foi amplificado com sucesso as sequências especificas da gripe A e Neuraminidase, usando o material das amostras. Os resultados sugerem que esta estratégia poderia ser útil quando as amostras clínicas de RNA são em quantidade limitada, ou quando é de má qualidade. Porque é um método muito sensível, que detecta o RNA viral neuraminidase em amostras de pulmão de pacientes que morreram de pneumonia causada pelo surto de Influenza A (H1N1) na Cidade do México.

44 Hot-Start PCR Variação do PCR, onde a reação de amplificação é iniciada à temperaturas elevadas.

45 Protocolo

46 Aplicações Testes genéticos; Diagnóstico clínico; Exames de sangue; Forense; Biodefesa.

47 Vantagens Aumenta a especificidade, a sensibilidade e a rentabilidade do produto; Ideal para ensaios Quantitativos Ensaios Multiplex

48 Vantagens Sem Hot-start Com Hot-start

49 Desvantagens Maior risco de contaminação Trabalho intensivo

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52 Artigo Objetivo: detectar a Babesia bigemina e Babesia bovis em bovinos de Moçambique, utilizando dois métodos distintos de PCR. Métodos: Para este estudo, amostras de sangue foram coletadas em uma fazenda. As amostras de DNA foram analisadas usando o PCR nested e o hot start PCR. Os primers foram selecionados para o hot start PCR baseado no suposto gene de uma protease aspártica, a babesipsin, presente em ambos Babesia bovis e Babesia bigemina. Resultados: A combinação da hot start e primers longos (29-31 pb) foram determinantes neste estudo para o sucesso da amplificação e detecção, além de que sensibilidade foi aumentada. O babesipsin no hot start PCR foi mais sensível do que a PCR nested. Um total de 117 amostras de campo foram testadas, 104 foram positivas para Babesia bigemina (90%), 97 foram positivas para Babesia bovis (82%), 86 foram infecções mistas (52%) e apenas 2 foram negativas para ambas as espécies de Babesia (1,7%). Conclusão: Os resultados confirmam que esta doença deve ser considerada como uma ameaça para o gado importado.

53 Bibliografia

54 Obrigada!!!

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