Biologia molecular aplicada ao diagnóstico de vírus

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1 Biologia molecular aplicada ao diagnóstico de vírus Tânia Rosária Pereira Freitas Pesquisadora em Ciências Exatas e da Natureza Virologia Animal - Lanagro/MG

2 Biologia Molecular DNA RNA Proteínas

3 Célula Animal

4 Núcleo Celular: cromossomas

5 Desenovelando o cromossoma

6 Gene

7 DNA Ácido Desoxirribonucléico

8 DNA: estrutura e composição Molécula de DNA: duas cadeias ou fitas de nucleotídeos. Nucleotídeos: açúcar + fosfato + base nitrogenada Disposição: As bases nitrogenadas estão no centro da molécula e os esqueletos açúcar-fosfato estão externos.

9 Nucleotídeos Cada nucleotídeo contém 1 a 3 grupos fosfato (PO4-) ligado ao carbono 5 do açúcar 2 -desoxi D ribose 1 base nitrogenada ligada ao carbono 1 do açúcar

10 Bases Nitrogenadas Purinas Pirimidinas

11 Bases complementares Complementaridade entre as bases: Adenina estabelece duas ligações de hidrogênio com Timina Citosina estabelece três ligações de hidrogênio com Guanina Relação molar A/T = 1,0 e C/G = 1,0

12 Nucleotídeos Direção de crescimento: Ligações fosfodiester entre o grupo fosfato 5 de um nucleotídeo e o grupo hidroxila 3 de outro. Uma das extremidades tem fosfato livre 5 e o nucleotídeo da outra apresenta um hidroxila 3 livre.

13 RNA Ácido ribonucléico

14 RNA: Composição Similar ao DNA: Bases nitrogenadas Base nitrogenada: uracila (substitui a timina) Açúcar: ribose Grupamento fosfato Fita única Altamente reativo

15 Tipos e funções RNA mensageiro ou mrna : carrega a informação (código genético) para síntese protéica (Tradução) RNA transportador, de transferência ou trna: transporta o aminoácido até o maquinaria de tradução. RNA ribossômico ou rrna: compõe a estrutura física do ribossoma, local onde se processará a tradução.

16 Mecanismos Moleculares Replicação do DNA Transcrição Tradução

17 Mecanismos moleculares Replicação do DNA Nova molécula de DNA Transcrição do DNA Produz moléculas de RNA Tradução do RNA Produção de Proteínas

18 Replicação do DNA

19 Replicação do DNA Replicação: Uma molécula de DNA dupla fita (parental) pode se replicar originado duas moléculas de DNA (filhas). Dinâmica: a replicação envolve a ação simultânea e integrada de: Enzimas DNA polimerase, Primases, Helicases, etc Vários fatores protéicos Nucleotídeos e RNA

20 Replicação do DNA

21 Replicação: Semi conservativa

22 Transcrição Síntese de RNA

23 Transcrição do DNA: Síntese de RNA Procariotos RNA polimerase separa os pares de base do DNA, desenrolando o DNA, dando início a síntese de RNA, formando uma bolha de transcrição no DNA. Eucariotos a transcrição envolve 3 classes de RNAs polimerases nos seus núcleos: Polimerase I: sintetiza o precursor de rrna (subunidade maior). Polimerase II: sintetiza precursores dos mrnas. Polimerase III: sintetiza os RNAs pequenos, os trnas e o rrna ribossômico (subunidade menor)

24 Transcrição: Uma cópia do gene (DNA) é transcrita em RNA

25 Transcrição do mrna

26 Processamento do mrna: transcrito primário: splicing hnrna

27 mrna RNAm contém uma seqüência linear de bases que são complementares ao DNA que serviu de molde.

28 Transcrição do trna

29 RNA transportador ou de transferência

30 Transcrição rrna

31 Rna ribossômico ou rrna

32 Ribossomas

33 Código Genético Códons: Trios ou tripletos de bases do ácido nucléico (DNA e RNA). No RNAm os códons podem ser: iniciadores (códon de iniciação), podem especificar um dos 20 diferentes aminoácidos que são encontrados normalmente nas proteínas finalizadores (códon de terminação) O códon é dito degenerado pois mais de um tripleto pode especificar o mesmo aminoácido

34 Código genético: códons

35 Tradução Síntese de proteínas

36 Tradução RNA mensageiro RNA transportador Ribossomas Vários fatores protéicos Enzimas

37 Tradução

38 Transcrição/Tradução

39 Dogma Central

40 Genomas

41 Virologia Molecular Diagnóstico Molecular

42 Vírus Parasitas intracelulares obrigatórios Genoma: DNA ou RNA Simples ou complexos Mecanismos de replicação Utilizam a maquinaria celular Interferem no metabolismo celular

43 Vírus: classificação

44 Vírus RNA

45 Vírus DNA

46 Vírus DNA: Herpes

47 Aplicação de métodos moleculares Custo x Benefício Conhecimento em biologia molecular Equipamentos, insumos biológicos e reagentes Tipo de infecção Aguda ou crônica Tipo de Amostra Corte de tecidos Excreções e secreções Sistemas de Replicação viral Animais Cultivos celulares

48 Virologia Molecular Métodos: Análise genômica Diagnóstico

49 Conhecimentos precursores Eletroforese em gel Gel de Poliacrilamida PAGE Proteínas Gel de Agarose ácidos nucléicos Enzimas de restrição Mapas de restrição Padrão de cortes

50 Eletroforese em gel Técnica de separação de moléculas Migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho: Poros do gel Menor massa migração mais que as de maior massa.

51 Eletroforese

52 Eletroforese de fragmentos de DNA em gel de agarose

53 Enzimas de Restrição (1953): Bacteriófago fenômeno de restrição/modificação Nucleases bacterianas altamente específicas que clivavam o DNA estranho. Degradação do DNA estranho (restrição). Proteção do próprio DNA pela metilação (modificação).

54 Enzimas de restrição

55 Enzimas de restrição Enzimas e organismos de origem Ava I- Anabaena variabilis: C* C/T C G A/G G Bam HI - Bacillus amyloliquefaciens: G* G A T C C Bgl II- Bacillus globigii: A* G A T C T Eco RI - Escherichia coli RY 13: G* A A T T C Eco RII- Escherichia coli R245: * C C A/T G G Hae III - Haemophilus aegyptius: G G * C C * Local do corte

56 Enzimas de restrição: Clivagens

57 Aplicação Enzimas de restrição Padrões de corte Mapas de restrição Tecnologia do DNA Recombinante Clonagem Vetores Inserção e deleção de genes

58 Mapeamento de restrição

59 Mapa de restrição de Herpesvirus suíno1 (doença de Aujeszky)

60 Mapa de restrição: Plasmídeo

61 DNA recombinante: clonagem

62 Diagnóstico molecular Técnicas de Hibridização de ácidos nucléicos

63 Hibridizações Definição: pareamento dos nucleotídeos em fitas complementares de DNA ou RNA Hibridização in situ Sondas ou Probes Blotting North blotting South blotting

64 Hibridização: conceito

65 Hibridização in situ - ISH Pareamento: DNA-DNA; DNA-RNA; RNA-RNA Detecção de DNA ou mrna: Localizar com precisão um gene específico ou seus transcritos em um tipo de população celular ou áreas. Detectar a presença do DNA ou RNA infecciosos em processos patológicos. Oncogênese

66 Hibridização in situ - ISH Amostras: Fixação - Paraformaldeído estéril 4% Desidratação - Sacarose 30% Polímero inerte (criomolde) e Congelamento e cortes em criostato (-10 m) Sondas: DNA, cdna e crna e oligonucleotídeos Marcação Radioisótopos ( 3 H, 35 S, 135 I, 32 P) Biotina, fosfatase alcalina Fluorescente

67 Hibridização in situ

68 FISH sonda fluorescente

69 Sonda marcada com radioisótopos

70 North blotting e South blotting

71 Northern Blot: RNA Técnica para estudar a expressão gênica Verificar se um determinado gene de um genoma é ou não transcrito em RNA Quantificar esse transcrito Utilizando sonda de DNA Envolve a técnica de eletroforese do ácido nucléico A fixação num suporte sólido

72 Northern Blotting

73 Southern blot: DNA

74 Western Blotting Especificação de uma proteína viral através de anticorpos específicos Bandeamento da proteína pela eletroforese em gel de poliacrilamida - PAGE Transferência para membrana de nitrocelulose Incubação com anticorpos policlonais ou monoclonais conjugados com enzimas (Peroxidase) ou substâncias luminescentes Revelação: Cromógeno (OPD)

75 WB

76 Reação em Cadeia de Polimerase PCR RT/PCR Extração do genoma Purificação Produção de cdna Amplificação Seqüênciamento Análise (edição) Dendogramas Tipos e topotipos virais

77 PCR: Polymerase Chain Reaction Definições: PCR: amplificação de uma seqüência ou fragmento da molécula de DNA. O fragmento a ser amplificado é delimitado por seqüências iniciadoras (primers) RT-PCR: Vírus com genoma RNA é necessário produzir o DNA complementar cdna

78 PCR: dinâmica

79 Produto do PCR

80 Vírus da Febre Aftosa VP1

81 Ciclo viral

82 Vírus da Febre Aftosa: Foot-and-mouth disease virus (FMDV) Serotype: Foot-and-mouth disease virus O (FMDV-O) 5' UTR L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B 1 3B 2 3B 3 3C 3D 3' UTR Serotype: Foot-and-mouth disease virus A (FMDV-A) 5' UTR L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B 1 3B 2 3B 3 3C 3D 3' UTR Serotype: Foot-and-mouth disease virus C (FMDV-C) 5' UTR L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B 1 3B 2 3B 3 3C 3D 3' UTR

83 Metodologia Amostras com vírus inativado (tecido, raspado esofágico faríngeo, cultivo celular, etc.) Extração do RNA Viral (Chomczynski & Sacchi, 1987) Método homogeneização da amostra em tiocianato de guanidina + ß-mercaptoetanol (100mM), fenol, precipitação em álcool. RNA em Trizol (fenol + tiocinato de guanidina)

84 Extração do RNA

85 Transcrição do RNA viral - RT RNA viral 5 AAAA 3 Enzima: Transcriptase reversa cdna

86 Amplificação do cdna obtido pela Reação da Cadeia de Polimerase IIII cdna IIII Taq DNA Polimerase Iniciadores da seqüência 1D (VP1) N= No.2 n

87 Iniciadores aplicados na PCR Primer Seqüência Tamanho Local. O dir ACCAACCTCCTTGATGTGGCT A dir TACCAAATTACACACACGGAA C dir TACAGGGATGGGTATGTGTGTACC Iniciador Reverso (para os três sorotipos) LMR GACATGTCCTCCTGCATCTG

88 Produtos do PCR PM CN PM 1301 pb 863 pb 813 pb 1:C 3 Rezende/Bra/55 2: A 24 Cruzeiro/Bra/55 3: O 1 Campos/Bra/58

89 Purificação dos produtos da PCR Kit Comercial (Concert Rapid Gel Extraction System, GIBCO-BRL) Pureza e Rendimento Purificação dos fragmentos de DNA por afinidade Eletroforese ( Peso e massa) Eluição do produto amplificado

90 Quantificação dos produtos purificados 2000pb = 200ng 1200pb = 120ng 800pb = 80ng 860 pb 80ng 400pb= 40ng 200pb= 20ng 100pb=10ng

91 Seqüênciamento Cíclico Preparar amostras para o seqüênciamento automático Similar ao PCR: Polimerizar o produto do PCR com nucleotídeos fluorescentes Kit Comercial (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Applied Biosystems) Pelo menos 60ng/amostra Designação Seqüência (5-3 ) Localização Iniciador Universal: (sentido reverso) GAAGGGCCCAGGGTTGGACTC

92 Seqüênciamento de nucleotídeos: eletroforese capilar e cromatogramas

93 Dendogramas e Topotipos

94 Muito Obrigada!

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