PUCRS CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Genética I AULA PRÁTICA APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE PCR E ELETROFORESE DE DNA

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1 Analise a seguinte situação hipotética (1): Uma equipe de pesquisadores está realizando um inventário da biodiversidade de uma área tropical ainda inexplorada, porém já sofrendo grande impacto de fragmentação antropogênica. Um dos principais focos de interesse dos botânicos participantes da equipe é a identificação de populações remanescentes de uma espécie rara e altamente ameaçada de árvore, endêmica daquela região. A identificação desta espécie em fragmentos de floresta é, portanto, muito importante para a definição a priorização de áreas a serem protegidas. Um desafio para estes pesquisadores é a identificação desta espécie, que pode ser diferenciada morfologicamente de espécies próximas (também presentes na área) apenas por características da flor. O cronograma das coletas de campo e da definição de ações de conservação nestas áreas inviabiliza a espera do período de disponibilidade de flores desta árvore. Assim sendo, os botânicos e geneticistas da equipe desenvolveram um método de identificação molecular desta árvore, através da técnica de PCR. A partir de seqüências previamente analisadas de um intron nuclear, identificou-se uma diferença de 200 pb entre o segmento desta espécie e o das demais árvores deste gênero, permitindo o desenho de um ensaio de tipagem em gel de agarose. O fragmento amplificado desta espécie apresenta 400 pb, enquanto aqueles das demais espécies apresentam 200 pb. Com base neste ensaio, analise amostras de DNA obtidos de folhas de 2 árvores candidatas localizadas nestes fragmentos florestais.

2 Analise a seguinte situação hipotética (2): Técnicos de um laboratório de pesquisa forense atuando em parceria com o Ministério do Meio Ambiente e a Polícia Federal recebem diversos carregamentos de amostras de animais, plantas e produtos naturais apreendidos com o objetivo de identificarem as espécies e/ou populações envolvidas. Esta identificação é necessária para que as devidas medidas penais sejam aplicadas a indivíduos indiciados por crimes como tráfico de animais silvestres, e também acusados de praticar biopirataria ou outros usos indevidos de componentes da biodiversidade. Abordagens moleculares são extremamente úteis nestas análises, entre elas o uso de PCR para caracterizar segmentos específicos de DNA. Um indivíduo é preso em um aeroporto com um carregamento escondido de 30 ovos, que as autoridades suspeitam serem provenientes de uma espécie ameaçada de ave, e terem por destino o tráfico internacional de animais. Análises externas iniciais indicam que os embriões contidos nos ovos morreram durante o transporte, e seu estágio de desenvolvimento permite apenas uma identificação morfológica a nível de gênero. Este gênero contém duas espécies, uma delas altamente ameaçada (e não representada em criadouros) e a outra bastante comum, e não ameaçada. O homem preso alega que os ovos pertencem a esta segunda espécie, e provêm de um criadouro comercial. O laboratório dispõe de um ensaio molecular baseado na amplificação por PCR de um segmento do DNA mitocondrial, em que há uma banda-controle de 600 pb nas duas espécies do gênero, e uma segunda banda de 200 pb apenas na espécie ameaçada. Compare o resultado deste ensaio em três amostras: (1) amostra-controle da espécie comum; (2) amostra-controle da espécie ameaçada; e (3) amostra de um dos ovos apreendidos.

3 Analise a seguinte situação hipotética (3): Modificada a partir de um conceito original do Prof. Carlos A. S. Ferreira (PUCRS) Organismos transgênicos são cultivados e comercializados em vários países do mundo, porém em outros eles têm a sua comercialização proibida. Além disso, algumas empresas de alimentação certificam os seus clientes que não utilizam organismos transgênicos e/ou alimentos produzidos com o uso de defensivos agrícolas fora dos padrões recomendados pela legislação. No caso de transgênicos, esta garantia somente pode ocorrer através de análises que incluam testes para a detecção de alterações genéticas. Alternativamente, a empresa pode produzir todos os organismos que utiliza em seus alimentos. Um dos organismos transgênicos mais comercializados é a uva contendo maior concentração de resveratrol. A alteração genética introduzida foi a inserção de um gene que aumenta a produção de resveratrol, o qual é semelhante a um gene naturalmente presente na videira. Este gene pode ser detectado pela técnica do PCR utilizando iniciadores específicos, sendo que o fragmento amplificado a partir do gene naturalmente presente na videira apresenta 600 pb enquanto que o gene introduzido artificialmente apresenta 200 pb. Analise o resultado de 2 testes originados de produtores de diferentes regiões.

4 Analise a seguinte situação hipotética (4): Muitas doenças genéticas humanas são causadas por alterações na seqüência de DNA de genes envolvidos em aspectos importantes de nosso metabolismo. Estas alterações (mutações) incluem mudanças em bases específicas (p. ex. de A para G), bem como deleções (ou seja perda de um segmento) ou inserções (ou seja adição de um segmento em uma localização atípica, p. ex. dentro de um exon). A doença hipotética X resulta da deleção (perda) de um segmento de 400 bases no exon 5 do gene hipotético ABC204. Este exon codifica uma parte importante da proteína produzida a partir deste gene, de forma que a perda de 400 bases neste segmento resulta em uma proteína não funcional, levando a uma doença metabólica grave quando em homozigose. A presença desta deleção pode ser detectada por PCR, utilizando primers localizados em regiões adjacentes do exon 5. O alelo normal produz um fragmento de PCR de 600 bases, enquanto o alelo defeituoso (portando a deleção) produz um fragmento de 200 bases. Pessoas normais têm 2 cópias do alelo normal (ou seja são homozigotas para este alelo); pessoas exibindo a doença têm 2 cópias do alelo defeituoso; e pessoas portadoras da doença (não exibem o problema mas podem transmiti-lo aos seus filhos) têm uma cópia de cada alelo. Analise o resultado de 3 testes derivados de amostras de diferentes pacientes que têm suspeita da doença X.

5 Analise a seguinte situação hipotética (5): Modificada a partir de um conceito original do Prof. Carlos A. S. Ferreira (PUCRS) Vários alimentos podem ser contaminados por uma série de microorganismos patogênicos e não patogênicos. Estes microorganismos podem em muitos casos alterar características importantes destes alimentos ou de produtos gerados a partir deles. A detecção destes microorganismos, desta forma, acaba sendo muito importante para a qualidade e segurança alimentar. A detecção da bactéria patogênica Salmonella enteritidis pode ser realizada através da amplificação específica de um fragmento de DNA pela técnica de PCR. O fragmento amplificado faz parte de uma região correspondente ao gene que codifica uma porina (proteína presente na membrana externa), e possui um tamanho de 400 pb. Outras enterobactérias não patogênicas gram-negativas, porém incluindo algumas capazes de alterar significativamente características importantes de alimentos, também apresentam uma porina cujo gene permite amplificação por PCR utilizando os mesmo iniciadores. O fragmento gerado, entretanto, é maior (750 pb). A análise dos alimentos suspeitos envolve uma etapa de enriquecimento, a qual se segue a extração e precipitação de DNA. Este material é submetido ao PCR. Analise o resultado de 3 destes testes, a partir de DNA extraído de diferentes lotes de salada de batata com maionese.

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