SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO DE DNA: MÉTODOS E PRINCÍPIOS

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1 SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO DE DNA: MÉTODOS E PRINCÍPIOS PIOS Cristiane Kioko Shimabukuro Dias Pós-doutorado - FAPESP Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Departamento de Morfologia Instituto de Biociências UNESP Botucatu (SP) DEFINIÇÃO Determinar a seqüência de nucleotídeos 1

2 HISTÓRICO Watson e Crick Modelo dupla hélice do DNA HISTÓRICO Década de 70 2

3 MÉTODOS CLÁSSICOS 1977 Seqüênciamento de DNA Maxam e Gilbert - método de degradação química Tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula de DNA em nucleotídeos específicos Sanger et al. - método enzimático, dideoxi ou de término da cadeia Síntese enzimática de uma fita complementar, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo MÉTODO DE DEGRADAÇÃO QUÍMICA enzima de restrição X X X aquecimento e purificação 3

4 MÉTODO DE DEGRADAÇÃO QUÍMICA Especificidade de bases G Químico usado para alteração de bases Dimetilsulfato Químico usado para remoção de bases Químico usado para a clivagem da fita A+G Ácido Ácido C+T Hidrazina C A>C Hidrazina + álcali Álcali MÉTODO DE DEGRADAÇÃO QUÍMICA G A+G C+T C 4

5 MÉTODO ENZIMÁTICO DNA fita simples DNA polimerase primer Animação MÉTODO ENZIMÁTICO X MÉTODO DE DEGRADAÇÃO QUÍMICA 5

6 Métodos de seqüenciamento manual Método enzimático mais utilizado, seqüenciamento de genomas, automação Método de degradação química substâncias químicas, caracterização de oligonucleotídeos ou no seqüenciamento de estruturas ricas em GC SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO MANUAL 6

7 SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO AUTOMÁTICO TICO SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO AUTOMÁTICO TICO Anos 80 seqüenciador semi-automático Substituição das técnicas de detecção por radioatividade pelo uso de marcadores fluorescentes Radioisótopos danosos à saúde, dificuldade de automação Fluorófos sistema de detecção que permite a leitura automática das seqüências Preparação do gel e aplicação das amostras Utilização ddntps fluorescentes lidos automaticamente durante a eletroforese Corantes fluorescentes reações no mesmo poço no gel 7

8 SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO AUTOMÁTICO TICO Seqüenciamento em ciclos ou por amplificação linear SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO AUTOMÁTICO TICO animação 8

9 SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO AUTOMÁTICO TICO Anos 90 - Seqüenciadores de capilares 9

10 SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO AUTOMÁTICO TICO Seqüenciadores automáticos avanço para a genômica, poucas centenas de pb Seqüenciadores de capilares - completamente automatizados duas vezes mais rápidos, Associação de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecção através de fluorescência confocal excitada por laser SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO AUTOMÁTICO TICO 10

11 Eliminação da montagem da placa e preparação do gel Aplicação das amostras por eletroinjeção Alta velocidade e resolução na separação das amostras Eliminação do retraqueamento OUTRAS TÉCNICAS T DE SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO Piroseqüenciamento Seqüenciamento por hibridação Colônias da polimerase Seqüenciamento por nanoporos Espectrometria de massa Massively Parallel Signature Seuqencing Determinação de SNP, reseqüenciamento, análise da expressão gênica 11

12 OUTRAS TÉCNICAS T DE SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO Piroseqüenciamento tempo real, seqüenciamento por síntese Método rápido, seqüências menores, genotipagem de SNP, tipagem microbiana, reseqüenciamento de genes para doenças e determinação da seqüência de DNA com estruturas secundárias complexas OUTRAS TÉCNICAS T DE SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO SBH complementariedade de pares de bases da molécula de DNA (4n=5) = 1024, reseqüenciamento de DNA, seqüenciamento de novo e análise da expressão gênica 12

13 OUTRAS TÉCNICAS T DE SEQÜENCIAMENTO ENCIAMENTO Colônias da polimerase colônias de DNA de 1 µm de diâmetro que crescem numa lâmina para microscopia Produção das polônias Denaturação do DNA imobilizado Hibridação de um primer universal Primeira reação de extensão Microscópio de fluorescência de varredura Fluorescência removida Ciclos sucessivos Seqüência de cada polônia paralelo Estágio inicial, redução de custos; genotipagem e haplotipagem APLICAÇÕES Análise genômica Haemophilus influenzae (1995) Fago phix174 (Sanger et al., 1977) Homo sapiens (2003) 13

14 APLICAÇÕES Estudo sistemático dos genomas Avanço das técnicas de seqüênciamento Automação Equipamentos sofisticados e precisos Grande quantidade de dados APLICAÇÕES Genoma completo: 28 archebactérias, 357 bactérias e 22 eucariotos 14

15 APLICAÇÕES Ciência forense Análise filogenética APLICAÇÕES Conservação de espécies Epidemias virais 15

16 APLICAÇÕES DNA barcoding Genômica comparada Descoberta de drogas Screening genético OBRIGADA! 16

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