Tecnologia do DNA recombinante

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1 Tecnologia do DNA recombinante Tecnologia do DNA Recombinante déc. 70 conhecimento de mecanismos biomoleculares enzimas biológicas cortar DNA ligar DNA replicar DNA transcrever reversamente o RNA complementaridade em ácidos nucleicos 1

2 Replicação do DNA Síntese Separação das fitas por hidrólise Remoção do primer Ligação dos fragmentos de Okasaki Enzimas de Restrição (II) endonucleases de restrição proteínas monoméricas ou diméricas organismos procarióticos reconhecimento e clivagem de sequência específica (sítio de restrição) da dupla hélice de DNA exógeno DNA endógeno: metilado Grupo metil citosina 5-metilcitosina 2

3 Enzimas de Restrição (II) sítios de restrição: 4 a 8 pb simetria rotacional: sequências palindrômicas sítio de restrição nome da enzima origem (organismo) 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 GGCC 3 3 CCGG 5 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 5 CTCGAC 3 3 GAGCTC 5 BamHI EcoRI HaeIII PstI XhoI Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus aegyptius Providencia stuartii Xanthomonas holcicola Enzimas de Restrição (II) hidrólise de ligação fosfodiéster OH (3 )+ fosfato (5 ) extremidades: cegas coesivas BamH1 Fragmento de restrição Fragmento de restrição Criação de extremidades coesivas 3

4 Enzimas de Restrição (II) Enzimas de Restrição (II) sítio de restrição: 4pb sítio de restrição: 6 pb 4

5 DNA Ligase catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre duas moléculas requer: 3 OH livre 5 fosfato livre geração de moléculas recombinantes DNA Ligase baixas temperaturas 5

6 DNA recombinante Clonagem molecular Clones: descendentes de uma única célula Vetor de clonagem inserto de DNA Transformação introdução do DNA em células 6

7 Vetores de Clonagem transportam o inserto de DNA para dentro da célula hospedeira replicação autônoma sítio de clonagem sítio exclusivo de restrição Vetores de Clonagem plasmídeos bacteriófagos 7

8 Plasmídeos DNA circular dupla fita extracromossômico bactérias e algumas leveduras replicação autônoma indicadores diferenciais: genes de resistência a antibióticos ampicilina tetraciclina marcas auxotróficas mutante lac - transformação Plasmídeos insertos de até cerca de 9kb >9kb: cosmídeos shuttle vectors: aplicável para: organismos procarióticos (propagação) organismos eucarióticos (expressão) 8

9 Plasmídeos pbr322 clássico (déc.70) cerca de pb resistência à: ampicilina tetraciclina inativação por inserção Plasmídeos puc puc18/puc 19 cerca de pb lacz (β-galactosidase) amp R sem inserto com inserto 9

10 Plasmídeos Bluescript M13 + /M13 - cerca de 2.900pb derivado de puc promotores dos bacteriófagos T3 e T7 origem de replicação M13 BAC bacterial artificial chromosome baseado no plasmídeo F de E. coli insertos de até 300kb (vetor de alta capacidade) genoma humano genoma de Drosophila genoma de Arabidopsis thaliana 10

11 YAC yeast artificial chromosome manutenção em levedura insertos de até 1.000kb (vetor de alta capacidade) marcadores para seleção: TRP1 (triptofano) NEO (resistência a kanamicina) componentes funcionais de um cromosomo eucariótico Quanto maior o inserto, maior a chance de rearranjos e quimeras pyac 11

12 Bacteriófagos Bacteriófago λ λembl4 transfecção Bacteriófagos manutenção de genes essenciais à reprodução viral substituição de material não envolvido na reprodução viral (porção mediana) 12

13 Bacteriófagos Bacteriófago M13 não destrói a célula hospedeira pouca estabilidade sequenciamento OK biblotecas +/- Vetores de Expressão geração de um produto gênico vetores: procarióticos eucarióticos 13

14 Procariotos Eucariotos Região reguladora mais extensa e complexa Presença de íntrons e éxons 14

15 Vetores de expressão procarióticos Escherichia coli, Bacillus subtilis plasmídeos promotores eficientes sítios de ligação ao ribossomo criação de vetores híbridos sistemas com promotores induzíveis sistemas de fusão nem sempre capazes de produzir proteínas funcionais de genes eucarióticos Vetores de expressão procarióticos 15

16 Vetores de expressão eucarióticos leveduras origem de replicação eucariótica regiões controladoras de transcrição, tradução e modificações eucarióticas poliadelinação/capping introns Vetores de expressão eucarióticos Características essenciais: 1. promotor induzível ou constitutivo: alto nível de transcrição 2. processamento de RNAm e tradução 3. terminador da transcrição 4. marca de seleção 5. ori de procariotos propagação em bactéria 16

17 Vetores de expressão eucarióticos Tecnologia do DNA Recombinante inserto vetor DNA recombinante 17

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