BIOLOGIA MOLECULAR. Prof. Dr. José Luis da C. Silva

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1 BIOLOGIA MOLECULAR Prof. Dr. José Luis da C. Silva

2 BIOLOGIA MOLECULAR A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com especial foco no estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente, a Biologia Molecular investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese protéica. Relação com outras ciências biológicas de nível molecular.

3 Programa (Ementa) Visão histórica do gene 11/06 Estrutura e função do DNA e RNA 11/06 Replicação, transcrição e tradução 11/06 Regulação da Expressão gênica 12/06 Tecnologia do DNA recombinante 12/06 Genômica e Bioinformática 09/07 PCR e Marcadores moleculares 09/07 Aplicações da Biologia molecular 10/07 (Seminários) Eletroforese em gel 10/07 (prática)

4 Evolução do conceito de gene O conceito de gene não é estático, ele se desenvolveu através de várias fases, desde que Wilhelm Johansen criou o termo em 1909, e continua evoluindo 1866 Mendel definiu como caráter ou fator unitário que controlava uma característica fenotípica, tal como a cor das flor em ervilhas Garrod definiu como um gene mutante-um bloqueio metabólico 1939 Beadle e Tatum definiram como um gene uma enzima 1960 Yanofsky e Brenner redefiniram um gene um polipeptídeo Refinando o conceito: O gene é uma unidade de informação genética que controla a síntese de um polipeptídeo ou uma molécula de RNA estrutural

5 Do gene ao efeito no organismo

6 Estrutura e função dos ácidos nucléicos

7 Estrutura dos ácidos nucléicos Nucleotídeos Ribonucleotídeo

8 Estrutura dos ácidos nucléicos Bases Nitrogenadas

9 Estrutura dos ácidos nucléicos Fosfato 5 Estrutura 1ária covalente 3 OH Polímero de nucleotídeos

10 Estrutura dos ácidos nucléicos

11 As cadeias polinucleotídicas adotam estruturas em Hélice

12 Estrutura dos ácidos nucléicos Dupla hélice do DNA Watson e Crick (1953) DNA B é a forma mais estável em condições fisiológicas

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14 Estrutura dos ácidos nucléicos Formas de DNA Formas A e Z são encontradas em cristais de DNA. A forma A é favorecida em soluções mais concentradas. A forma Z pode estar associada com a regulação da expressão gênica recombinação in vivo. e

15 Dogma central da Biologia molecular

16 A replicação é semiconservativa Processo semiconservativo: Durante a replicação, as duas fitas do DNA parenteral são copiados, originando moléculas filhas com somente uma das fitas novas sintetizadas. (Meselson e Stahl, 1958)

17 Replicação do DNA O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA. A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases

18 Genoma procariótico

19 O genoma bacteriano circular constitue um único replicon Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)

20 DNA-POLIMERASES DNA-polimerase é a enzima que faz a síntese de uma nova fita de DNA. Possui a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3 OH de uma região pareada do DNA 5 3.

21 Movimento da forquilha de replicação: A partir da origem, a replicação prossegue ao longo da fita de DNA, em uma ou ambas as direções, seqüencialmente até o termino. Direção da replicação A adição dos nucleotídeos para o crescimento da cadeia é sempre no sentido 5 3.

22 Forquilha de replicação Fita contínua (líder) Fita descontínua

23 DNA polimerases de E. coli

24 PROTEÍNAS NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DA E. coli Animação replicação

25

26 Transcrição A transcrição é realizada por um sistema enzimático que converte a informação genética de um segmento de DNA (gene) em uma fita de RNA complementar à fita molde.

27 Fita molde (anti-senso) e codificadora (senso)

28 A transcrição de procariotos e de eucariotos possui três eventos principais: Iniciação - A RNA polimerase se liga a dupla fita do DNA na região denominada promotor. A iniciação é um passo muito importante na expressão gênica!!! Elongamento - adição covalente de nucleotídeos a extremidade 3' da cadeia polinucleotídica crescente; isto envolve o desenvolvimento transitório de um curto trecho de DNA fita simples. Término - Reconhecimento da sequência de término e liberação da RNA polimerase. Embora a transcrição seja realizada pela RNA polimerase, outras enzimas são necessárias para produzir o transcrito, além de outras proteínas. Estes fatores ou se associam diretamente com a RNA polimerase ou auxiliam na formação do aparato transcricional. O termo utilizado para descrever estas proteínas é fatores de Transcrição.

29 Iniciação: Reconhecimento dos promotores Reconhecimento dos promotores pela subunidade σ70 da RNA polimerase em E. coli. Em condições fisiológicas a RNA pol está provavelmente ligada ao DNA, mas o reconhecimento depende da subunidade sigma. ATG Extremidade 5 do gene (Montante)

30 Sequências consenso Regiões -35 e -10 (TATA box ou Pribnow box) Essas sequências são reconhecidas pela subunidade sigma70. Outros promotores apresentam alguma variação nas sequências consenso. Após a ligação ao promotor e início da síntese, a subunidade sigma é liberada e funciona como um catalisador para outra RNAP ligada à um outro promotor ou ao mesmo promotor.

31 O reconhecimento do promotor depende de seqüências consensuais. Um promotor típico possui três componentes, sendo formado pelas seqüências consensuais em 10 e 35 e pelo sítio de início da transcrição. A comparação com mais de 100 genes de E. coli, chegou-se as seguintes conclusões: 1) O primeiro nucleotídeo a ser transcrito (+1) é geralmente uma purina (A ou G). 2) Duas seqüências são altamente conservada nos genes comparados: uma localizada na região 10, que tem como consenso a seqüência TATAAT (TATA box ou Pribnow box), e outra localizada na região 35, que tem como consenso a seqüência TTGACA, 3) Que as regiões 10 e 35 são separados por 17±1 nucleotídeos (equivale a duas voltas da hélice).

32 Os fatores sigma de E. coli reconhecem promotores com diferentes seqüências consensuais

33 Complexo de Iniciação Complexo fechado Complexo aberto e iniciação Liberação do sigma

34 Complexo aberto bolha de transcrição

35 Fase: Alongamento Após o desligamento da subunidade sigma ocorre uma alteração conformacional na RNAP tornando-a mais esférica e ativa durante o processo de alongamento. O processo não é contínuo em algumas regiões, principalmente porque ocorre tradução simultânea do mrna em bactérias. Ocorrem paradas rápidas e retomadas da transcrição. A processividade é alta e a transcrição tem um índice de erro de 10-5.

36 Ação da toposiomerases no relaxamento dos supercoil positivo

37 Fase: Término da transcrição O RNA sintetizado participa ativamente do término de sua síntese, formando estruturas secundárias ou ligando-se a outros fatores. Em E. coli: Terminação dependente de rho (ρ) Terminação independente de rho (ρ)

38 Terminação independente de rho (ρ) Este tipo de terminação é responsável pelo término da transcrição de 90% dos genes bacterianos. Uma sequência na região 3 do gene, sinaliza o final da síntese do RNA. É uma sequência repetida de As na fita molde (Us no RNA) que ocasiona uma longa pausa no alongamento da cadeia. Nessa pausa ocorre o pareamento A:U entre a fita molde e o RNA desestabilizando o híbrido RNA/DNA. Este processo é auxiliado por uma proteína denominada NusA nucleotídeos antes do término rico em As é formado por sequências autocomplematares que formarão grampo de RNA.

39

40 Terminação dependente de rho (ρ) Não existem sequências ricas em As específicas, mas podem haver sequências autocomplementares. A proteína Rho migra até encontrar a RNA pol parada e sua atividade helicase DNA/RNA dependente de ATP auxilia no desligamento do RNA sintetizado.

41 Transcrição em Eucariotos RNA - POLIMERASES RNA - Polimerase I: rrna RNA - Polimerase II: mrna RNA - Polimerase III: trna e outros RNAs nucleares pequenos

42

43 Um gene tipo transcrito pela RNA-polimerase II possui um promotor que se estende a montante a partir do sítio onde a transcrição é iniciada. O promotor contém vários elemento de seqüências curtos (<10pb), aos quais se ligam os fatores de transcrição, espalhados por >200pb. Um reforçador (enhancer), contendo elementos mais compactamente organizados, ao qual também se ligam fatores de transcrição, freqüentemente são alvos para a regulação tecidoespecífica ou temporal.

44 Etapas são similares na transcrição, contudo o processo é muito mais complexo e regulado Animação da transcrição

45 Síntese de proteínas

46 Código Genético

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53 Tradução - poliribossomos Animação da tradução

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