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1 "PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO E INVESTIGAÇÃO DE DEFICIENCIAS GÊNICAS COM UTILIZAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA, OU PROCESSO PCR MULTIPLEX FLUORESCENTE". Trata o presente relatório da descrição detalhada acompanhada de 5 desenhos elucidativos de um novo processo para identificação e/ou investigação de deficiências gênicas em amostras de DNA, de seres humanos e/ou animais, o qual além de identificar e investigar deficiências gênicas conhecidas permite a identificação e estudo de alterações ainda não caracterizadas, sendo realizado através da reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) um composto fluorescente, de forma a obter uma série 10 maior de primers na reação, proporcionando uma leitura automatizada do resultado do processo e agilizando a obtenção desses resultados. As deficiências gênicas, ou deleções gênicas consistem em perdas de determinados fragmentos de DNA, levando, em muitos casos a desordens hereditárias, tais como Distrofia Muscular Duchenne e alterações das hemoglobinas, como 15 Talassemias (alfa, beta, delta-beta) e Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal (PHHF). O diagnóstico molecular de deficiências gênicas pode permitir o correto tratamento dos pacientes po rtadores destas alterações, além de fo rnecer as informações necessárias para o aconselhamento genético das famílias, evitando que outros indivíduos venham ser acometidos por estas desordens. Também, a investigação ou estudo de 20 deficiências gênicas nos laboratórios de pesquisa pode revelar novos casos, além de trazer importantes informações a respeito dos mecanismos que o riginam as deleções e seus efeitos no organismo. Os processos tradicionais de identificação e investigação das deficiências gênicas são extremamente laboriosos, demandam muito tempo e, em geral, utilizam

2 radioisótopos. O processo mais freqüentemente utilizado é o processo conhecido como o Southern-blot, que consiste basicamente em digerir o DNA com enzimas de restrição, separar os fragmentos em gel de agarose, transfe rir o DNA digerido para uma membrana de nylon ou nitrocelulose e hibridar, com sondas marcadas com compostos radioativos, 5 específicas para a região estudada. Os fragmentos observados após a revelação são comparados com fragmentos controles, quanto ao tamanho e a intensidade. Assim, podese inferir a localização aproximada dos pontos de quebra de grandes deleções gênicas. Este processo, todavia, requer DNA de alta qualidade, além de possuir aquelas características já mencionadas. lo O processo Southern-blot, acima citado é o processo mais tradicionalmente utilizado para a detecção de deficiências gênicas no grupo de genes da beta-globina. Este processo consiste basicamente na digestão do DNA por enzimas de restrição, eletroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos digeridos, transferência do DNA para uma membrana de nylon ou nitrocelulose, hibridização da 15 membrana como uma sonda, normalmente radioativa, específica para uma região do DNA de interesse, revelação e análise. O procedimento leva aproximadamente uma semana para cada sonda utilizada, e normalmente se utiliza uma série de sondas, o que torna este processo muito demorado e dispendioso, além de ter a desvantagem de utilizar material radioativo que tem manipulação complexa. 20 Outro processo conhecido é o processo denominado PCR ou Polymerase Chain Reaction, que permite amplificar uma região específica de DNA, utilizando iniciadores ou primers específicos e uma enzima polimerase termoestável. Este é, provavelmente, o processo mais utilizado nos dias de hoje, em laboratórios de Biologia Molecular, de pesquisa, de analises clinicas e diagnóstico. Sua especificidade,

3 3/7 flexibilidade e facilidade de execução permite que seja utilizado em uma ampla variedade de atividades de pesquisa e diagnóstico, corn relativa segurança e rapidez. O processo PCR, acima citado consiste em amplificar uma seqüência específica de DNA, através de ciclos sucessivos de desnaturação da dupla fita do DNA, a 5 uma temperatura em torno de 94 C, hibridização dos iniciadores, a uma temperatura em torno de C, e a síntese ou extensão da fita complementar por uma enzima polimerase termoestável, a uma temperatura em torno de 72 C. As reações ocor ridas, do tipo reação comum, são preferencialmente feitas em tubos eppendorf de 500µ1, com tampão apropriado, e contendo dn'1'ps ou nucleotídeos, um par de iniciadores lo específicos, a enzima polimerase e o DNA molde, sendo esses componentes colocados em um aparelho denominado termociclador, que realiza as variações de temperatura para cada etapa do ciclo de amplificação. Os fragmentos amplificados são normalmente visualizados em gel de agarose, corado com brometo de etidio. Este procedimento leva menos de um dia. Na detecção de deficiências gênicas, este processo utiliza-se apenas 15 quando se tem um prévio conhecimento da alteração a ser detectada, utilizando iniciadores que flanqueiam os pontos de quebra, este processo não é utilizado na detecção ou investigação de alterações ainda não caracterizadas. Isto se deve principalmente ao fato de ser dificil a identificação dos heterozigotos, condição onde há apenas um alelo, ou uma cópia do gene, deletada, já que normalmente os humanos e os 20 mamíferos possuem 2 cópias. No caso de homozigotos, condição onde há perda das duas cópias, a detecção se dá pela simples constatação de ausência de amplificação, já que aquela região alvo não está presente. O processo de identificação e investigação de deficiências gênicas no grupo de genes da beta-globina com utilização de fluorescência, ou PCR multiplex

4 4/7 fluorescente, objeto da presente patente, foi desenvolvido com o objetivo de aprimorar e obter um processo mais eficiente de detecção de deficiências gênicas em animais e seres humanos, o qual possa ser utilizado em grande escala e com grande rapidez. O mesmo é utilizado para detecção de grandes deleções de DNA no grupo de genes da beta globina, 5 associadas a Talassemias e outras alterações importantes das hemoglobinas, sendo que este processo apresenta todas as vantagens da técnica de PCR, ou seja, é mais rápido, de forma que dependendo do Seqüenciador utilizado, pode-se analisar aproximadamente 50 amostras em um ou dois dias, é um processo mais prático, além de utilizar compostos fluorescentes, que evitam o uso de radioisótopos e são mais sensíveis na detecção. Desta lo forma, este método foi desenvolvido para substituir de forma eficiente, por permitir a informatização do diagnóstico e maior rendimento em amostras analisadas, o processo Southern-blot, que é o mais utilizado atualmente em laboratórios de análises clinicas e de diagnóstico, para detecção de deleções. O novo processo PCR Multiplex Fluorescente, aqui descrito, foi 15 desenvolvido baseado no processo PCR comum, porém, aplicado na detecção das deleções, como é o processo Southern-blot, de forma a substituí-lo, já que, este é um processo demorado, laborioso, além de utilizar radioisótopos, enquanto que o processo PCR Multiplex Fluorescente é rápido, prático e utiliza fluorescência para a detecção de deficiências gênicas no grupo de genes da beta-globina. 20 A seguir faz-se referencia as figuras que acompanham este relatório descritivo, para melhor entendimento e ilustração do mesmo onde se vê: A Figura 1 mostra, o fluxograma do processo tradicionalmente conhecido como processo Southern-blot que utiliza sonda radioativa.

5 5/7 A Figura 2 mostra, o fluxograma do processo proposto neste relatório de patente, processo de identificação e investigação de deficiências gênicas com utilização de fluorescência, ou PCR multiplex fluorescente. O processo de identificação e investigação de deficiências gênicas no 5 grupo de genes da beta-globina com utilização de fluorescência, ou PCR multiplex fluorescente, objeto da presente patente, baseia-se no fato de que um indivíduo ou região do genoma normal (diplóide), que contém duas cópias de uma determinada seqüência, terá, ao final de um ciclo de amplificação, o dobro da quantidade de cópias que um individuo ou região que contenha uma deleção. Os iniciadores, que estarão presentes nas 10 cópias finais, são marcados com um composto fluorescente, através de uma reação, que possibilita sua detecção por aparelhos de sequenciamento automático. Utilizam-se vários pares de iniciadores para uma série de regiões do DNA, numa mesma reação, ou seja, múltiplos pares ou multiplex. Este processo pode ser utilizado tanto em casos de deficiências gênicas conhecidas, como para localizar alterações ainda não caracterizadas. 15 Neste caso, diferentemente do PCR comum, quantificam-se os níveis de amplificação de uma determinada região, pela intensidade de fluorescência, facilmente detectada em Seqüenciadores automáticos. Assim, uma região/indivíduo em heterozigose, com apenas uma cópia, pode ser detectada pela comparação com uma região/indivíduo normal, já que terá a metade dos níveis de amplificação, facilitando a detecção das deficiências 20 gênicas. O processo baseia-se na possibilidade de se identificar diferenças quantitativas na amplificação de amostras por PCR, em presença de deleções ou duplicações, onde o produto final de amplificação é diretamente proporcional à quantidade inicial de cópias da seqüência alvo. A utilização de p rimers marcados com

6 fluorescência aumenta a sensibilidade e praticidade do processo, já que, pode-se aplicar uma série maior de primers numa única reação (Multiplex), e automatizar os procedimentos de corrida e leitura das amostras. A leitura e análise das amostras se faz em software apropriado, que identifica os sinais, identificados por picos e áreas, emitidos 5 pelo composto fluorescente incorporado aos primers, através de uma reação química, feita na fase exponencial da mesma. A área de cada pico de fluorescência alvo é comparada com a área amplificada do pico controle interno, identificado como o diplóide do gene da (3actina, e outras regiões, para posterior cálculo da dosagem gênita e identificação da deleção, ou deficiência gênita, em comparação com uma amostra 10 controle. Assim, para cada etapa do processo pode-se desenhar uma série de pares inicias ou primers, marcados com um composto fluorescente, ao longo do cluster da (3- globina, reunidos em reações de multiplex, para um rápido rastreamento de deleções nesta região, identificando as deficiências de forma rápida e ampla. Desta forma, o processo, objeto da presente patente, consiste nas seguintes etapas principais: a) 15 extração do DNA; b) separação de uma série de iniciadores ou primers; c) reação da série de primers de uma só vez, com um composto fluorescente; d) análise do resultado da reação na fase exponencial da mesma, em Seqüenciador Automático, efetuando a comparação com os valores de controle; e) cálculo da dosagem gênica, através do software apropriado; e f) obtenção dos resultados e detecção das deleções ou 20 deficiências gênitas em varias regiões. Assim, pelas características acima descritas de nova funcionalidade, praticidade eficiência e rapidez, além de versatilidade de utilização tanto na área medica como na veterinário para análises em grande escala e evitar o uso de mate rial radioativo o "PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO E INVESTIGAÇÃO DE DEFICIENCIAS

7 GÊNICAS COM UTILIZAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA, OU PROCESSO PCR MULTIPLEX FLUORESCENTE", objeto da presente patente, reveste-se de condições para merecer o Privilégio de Patente de Invenção.

8 REIVINDICAÇÃO 1 - `PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO E INVESTIGAÇÃO DE DEFIC 1 ENCIAS GÊNICAS COM UTILIZAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA, OU PROCESSO PCR MULTIPLEX FLUORESCENTE", processo de identificação e 5 investigação de deficiências gênitas no grupo de genes da beta-globina com utilização de fluorescência, para detecção de deficiências gênicas em animais e seres humanos, caracterizado por consistir nas seguintes etapas principais: a) extração do DNA; b) separação de uma sé rie de iniciadores ou primers; c) reação da série de primers de uma só vez, com um composto fluorescente; d) análise do resultado da reação na fase lo exponencial da mesma, em seqüenciador Automático, efetuando a comparação com os valores de controle; e) cálculo da dosagem gênica, através do software aprop riado; obtenção dos resultados e detecção das deleções ou deficiências gênicas em va rias regiões.

9 1IL Southern-blot Extração do DNA 1-2 horas Digestão do DNA 5-16 horas Eletroforese e transferência do DNA para membrana horas Hibridação, Revelação e Análise horas Resultado horas Resultado para apenas uma sonda FIG. 1

10 LI PCR Multiplex Fluorescente Extração do DNA 1-2 horas PCR Multiplex 2-3 horas Análise em Sequenciador Automático 1-7 horas Cálculo do CDG 1 hora 5-13 horas Resultado Resultado para várias regiões FIG. 2

11 RESUMO "PROCESSO DE IDENTIFICAÇÃO E INVESTIGAÇÃO DE DEFICIENCIAS GÊNICAS COM UTILIZAÇÃO DE FLUORESCÊNCIA, OU PROCESSO PCR MULTIPLEX FLUORESCENTE". Novo processo para identificação 5 e/ou investigação de deficiências gênicas em amostras de DNA, de seres humanos e/ou animais, o qual além de identificar e investigar deficiências gênicas conhecidas permite a identificação e estudo de alterações ainda não caracterizadas, sendo realizado através da reação de um composto fluorescente, de forma a obter uma série maior de iniciadores ou primers na reação, proporcionando uma leitura automatizada do resultado do processo e 1u agilizando a obtenção desses resultados, permitindo a detecção das deficiências em várias regiões de uma só vez.

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