WHO GLOBAL SALM-SURV NÍVEL III

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1 WHO GLOBAL SALM-SURV NÍVEL III CAMPYLOBACTER spp. Multiplex PCR para detecção de C. jejuni e C. coli Grace Theophilo LRNCEB IOC/FIOCRUZ

2 Diagnóstico molecular para Campylobacter spp. Enterites associada a Campylobacter causa mais comum de diarréia bacteriana no homem Muitas espécies identificadas no TI de cães, gatos e outros animais Apenas um número limitado de espécies tem sido associado a doenças no homem: C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis

3 Diagnóstico molecular para Campylobacter spp. Caracterização Fenotípica Clássica Lentidão 5 dias Incerteza dúvidas na caracterização C. jejuni - culturas C. jejuni hipurato-negativas ocasionalmente encontradas (Totten et al. 1987; Rautelin et al. 1999) - C. jejuni subsp. doylei resultado variável - Culturas de C. lari oxidase-negativas Insuficiente

4 Diagnóstico molecular para Campylobacter spp. Caracterização Genotípica PCR Multiplex Rapidez 1 dia Precisão diferenciação entre espécies (C. jejuni e C. coli) Custo relativamente baixo

5 O que é uma reação de PCR Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Desenvolvida por Kary Mullis (1987) Fundamento: Técnica de amplificação in vitro de seqüências específicas do DNA Objetivo: Multiplicar um trecho específico do DNA, utilizando desoxinucleotídeos como monômeros até um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser detectável por métodos simples de separação de substâncias. PCR é uma técnica que consegue resolver um grande problema da análise de ácidos nucléicos: sua baixa quantidade na maioria dos tecidos vivos.

6 O que é uma reação de PCR Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) A multiplicação destes trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio entre Denaturação das cadeias do DNA genômico Anelamento dos primers usado para delimitar a seqüência a ser amplificada Temperatura ótima específica da enzima 72ºC Reinício do ciclo

7 O que é uma reação de PCR Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) como funciona 1 Passo Desnaturação Abertura da dupla fita do DNA 2 Passo Anelamento Onde ocorrer a ligação de pequenas seqüências previamente sintetizadas (primers) à seqüências complementares do DNA 3 Passo Extensão Onde a polimerase (enzima) copia a seqüência alvo a partir dos primers

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9 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Esquema dos processos realizados numa reação de PCR. Após a desnaturação das fitas molde, ocorre o pareamento dos primers. A enzima, representada em verde, adiciona os desoxinucleotídeos complementarmente às fitas-mãe.

10 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Passos finais de uma reação de PCR. A figura mostra as duas fitas-mãe, pareadas com as suas fitas-filha complementares, sintetizadas a partir da adição dos desoxinucleotídeos pela DNA polimerase.

11 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Técnica 3 etapas Preparo da amostra Preparo do Master Mix Amplificação da sequência-alvo

12 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Preparo da amostra Nesta etapa fazemos a extração do DNA da amostra a ser analisada Deve conter pelo menos um filamento intacto de DNA

13 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Campylobacter spp. Preparo da Amostra Extração do DNA da amostra a ser analisada Fervura - Método + rápido e econômico Uso de Kits comerciais - DNA purificado

14 Extração do DNA - fervura Amostras Isoladas Pegar uma alçada das colônias suspeitas (Agar sangue 42 C/ 24 h) 1,5 ml de solução fisiológica agitar Centrifugar x g ( 5-8 minutos) Descartar o sobrenadante Ressuspender o Pellet em 200 μl de água deionizada estéril Aquecer 100 C ( 10 minutos)

15 Extração do DNA - fervura Alimentos 25 g da amostra ml de sol. fisiológica Agitar 1 Deixar repousar por minutos 2 ml do sobrenadante + 18 ml Caldo Bolton (antibióticos) 1 ml do Caldo Bolton 42ºC/18h - microaerofilia Centrifugar x g/10 minutos Ressuspender o pellet em 1 ml de sol. fisiológica Centrifugar x g/10 minutos Ressuspender o pellet em 100 μl de água deionizada Aquecer 100ºC ( 10 minutos)

16 Preparo do Master Mix Componentes Concentração Objetivo Tampão 1X ph apropriado Cloreto de magnésio 1,5 mm cofator da enzima dntp 0,2 mm nucleotídeos para a síntese do DNA Primers 20 pmol molde para iniciar a cópia do DNA Taq DNA Polimerase 1 a 1,25 U enzima que liga os nucleotídeos

17 PRIMERS Campylobacter coli (364 pb) col1: 5 AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC 3 col2: 5 TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC 3 van de Giessen et al. (1998) Campylobacter jejuni ( 773 pb) jun3: 5 CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT 3 jun4: 5 AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC 3 Lawson et al. (1997)

18 PCR Campylobacter spp. Preparo do Master Mix Para volume final de 25 µl e 10 amostras REAGENTE VOLUME VOLUME FINAL Tampão 2,5 µl 25 µl dntp 2,0 µl 20 µl Primer 1 1,0 µl 10 µl Primer 2 1,0 µl 10 µl Primer 3 1,0 µl 10 µl Primer 4 1,0 µl 10 µl Taq polimerase 0,25 µl 2,5 µl Água deionizada 15,25 µl 152,5 µl DNA 1,00 µl 10,0 µl VOLUME TOTAL 250,0 µl

19 Detecção e Análise dos Produtos As bandas de DNA de fragmentos de peso molecular definido devem ser visualizadas em gel de agarose, coradas com uma solução de brometo de etídio, sob luz UV. Comparando as bandas do produto com as bandas de um marcador de peso molecular devemos ser capazes de identificar qualquer fragmento produzido de peso molecular adequado

20 Amplificação e Visualização

21 Melhores Resultados Uso de controles positivo e negativo Preparo das soluções de PCR em sala separada do preparo da amostra Autoclavação de água e soluções Uso de todo material novo Uso de luvas em todas as etapas Manipulação dos reagentes durante o preparo do mix em gelo

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