Técnicas Moleculares Aplicadas ao Estudo de Patologias

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1 Patologia x Genética Técnicas Moleculares Aplicadas ao Estudo de Patologias Lucas Brandão

2 Patologia Clínica Definição: Fornece informações ao médico, de modo a proporcionar-lhe os meios necessários para atuar na prevenção, diagnóstico, tratamento, prognóstico e acompanhamento das enfermidades de um modo geral.

3 Patologia Clínica Atua e ajuda: na realização de Exames laboratoriais Sangue, Urina, Fezes, Líquidos biológicos identificar e quantificar substâncias

4 Especialidades Química clínica Hematologia Sangue, Urina, Fezes, Líquidos biológicos imunologia Microbiologia parasitologia urianálise biologia molecular genética médica

5 Química clínica Hematologia imunologia Microbiologia parasitologia urianálise biologia molecular genética médica

6 Técnicas Moleculares Genética Clássica DNA Recombinante Biologia Molecular 6

7 Abordagem Citogenética Clássica FISH Southern Blot PCR PCR em tempo real Sequeciamento 7

8 São utilizadas para: 8

9 Aberrações Cromossômicas Numéricas Estruturais

10 Defeitos gênicos Deleções Inserções Duplicações Repetições em tandem SNPs

11 Procura de Invasores

12 Como conseguir o material Genético?

13 Vamos começar!!!! cromossomopatias 13

14 Citogenética São procedimentos utilizados para estudar os cromossomos metafásicos Construção do cariótipo humano Permitindo o diagnóstico de anomalias cromossômicas

15 Construção do cariótipo humano Cariótipo Conjuntos dos cromossomos organizados pelo tamanho e morfologia TELÔMERO NOR Constricção SECUNDÁRIA CENTRÔMERO (Constricção PRIMÁRIA) TELÔMERO

16 Cariótipo = informações Informações sobre o: Sexo do indivíduo Números de cromossomos Grandes alterações morfológicas

17 Análise do Cariótipo 1) Preparação da cultura 2) Preparação das lâminas 3) Coloração do preparado com corantes 4) Observação microscópica, seleção das metáfases e aquisição das imagens

18 Preparação do Cariótipo Sangue Periférico fitoemoagglutinina (Estimula o Crescimento) colchicina (ultimo 30 ) Hipotónica (20 ) proliferação 48-96h centrifugação centrifugação pellet risospeso Fixador Fixador Resuspensão Em pouco fixador splash pellet centrifugação (2-3)

19 Análise de cariótipo 1) Preparação da Cultura 2) Preparação das Vidrarias 3) Coloração do preparado com corante 4) Observação ao microscópio, Seleção da metáfase e acquisição da imagem

20

21 Síndrome do Miado do gato

22 Limitação NECESSIDADE DE CÉLULAS EM DIVISÃO ANÁLISE MOROSA E DEPENDENTE DO TÉCNICO INÚTIL PARA ALGUNS PACIENTES ANOMALIAS DETECTADAS COM SIGNIFICADO DESCONHECIDO MORFOLOGIA DOS CROMOSSOMAS POBRE

23 Reação em cadeia da polimerase 62

24 AMOSTRAS'PARA'SEREM'UTILIZADAS'NA' PCR!&sangue!&urina&!outros&fluidos&corporais!cabelo&!&cortes&de&tecidos&(biópsias&frescas&ou&em&blocos&de& parafina).& 12/02/09 63

25 Histórico Mullis inovou: Conseguiu especificidade na cópia de apenas segmentos específicos, introduzindo o conceito de primer de PCR, e na utilização de uma DNA polimerase termoestável. Mullis Taq DNA polimerase Permite a mudança na temperatura Primer Thermus aquaticus Especificidade da reação Fig. 1: Kary Mullis, inventor da PCR, em foto de 1994 (Nobel Academy) 4 Mimetizar a replicação do DNA em regiões específicas do genoma

26 PCR Aquecer Etapas Desnaturação DNA Inserir os Primers Anelamento Sintetizar um fita de DNA Extensão 7

27 Primers São pequenas seqüências! oligonucleotídeos DNA molde Primer Especificidade da Reação 8

28 Genoma 5 mil genes 3 Gene A C G C G C G A T T G C T G A A A G A A 3 OH T A A C G A C T T T C G C 3 OH 5 G C G 3 9

29 Taq polimerase Atividade ph Cofatores Temperatura Ideais A enzima "lê" a fita molde e faz a fita complementar incorporando deoxirribonucleotídeos trifosfatados 10

30 dntps Fosfato Açucar 11

31 Componentes 3 MgCl 2 dctptampão 3 OH G C G datp Gene A Taq dttp G C G dgtp 3 OH 5 12 Polymerase Chain Reaction

32 Etapas! Ciclos Desnaturação Extensão Anelamento Tempo 15

33 16 Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automático

34 17 Polymerase Chain Reaction

35 74

36 75

37 A quantidade de DNA final segue uma função exponencial, onde: N = N 0. 2 n N = Número final de cadeias de DNA N 0 = Número inicial de DNA molde (template) n = Número de repetições do ciclo Portanto, a concentração final do DNA molde na solução é muito maior (da ordem de 235 ) do que a inicial, possibilitando a sua identificação. 18

38 19

39 ANÁLISE DOS PRODUTOS DA PCR Eletroforese Horizontal Idéia Equipamentos 1

40 Produto da PCR 3 Gene A 5 2

41 Baseada Molécula de DNA Carga Tamanho e peso Negativa Agrupamentos fosfatos 3

42 Idéia Diferença de potencial Malha Eletroforese Geis - DNA + 4

43 Preparo da Amostra Amostra + Água + Tampão de amostra 11

44 12 Eletroforese

45 Eletroforese 50 a 100mV DNA Corante 13

46 Coloração com Brometo Duas estratégias Pré-corrida Pós-corrida BROMETO DE ETÍDIO C21H2OBrN3 A T T G C A T T A A C G T A 14

47 Visualização Aparelho que emite raios UV. As bandas podem ser identificadas como pequenas faixas fluorescentes 15

48 16 Ladder

49 Detecção'de'Patógenos'(HPV)!Primers&específicos&para&o&HPV&(MY09&e&MY11) HPV!Primers&específicos&para&um&gene&constitutivo&(globina)& globina Falsos&negativos 12/02/09

50 Visualização 1kb pv gb pv gb pv gb pv gb pv gb pv gb 12/02/09

51 Interpretação Caso : Diagnóstico viral

52 22 Interpretação

53 Interpretação pb 400pb 300pb 200pb 100pb 22

54 1 2 1a 1b 2a 2b 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb 97

55 54 RFLP

56 PCR'Comum 1º individuo A T T G C 2º individuo A G T G C

57 Interpretação'doenças'genéIcas'! RFLP Caso : Diagnós,co gené,co 1 2 Normal Mutante portador

58 ESTUDO DAS MUTACOES C282Y E H63D P/ HEMOCROMATOSE ESTUDO GENETICO DA MUTACAO S65C P/ HEMOCROMATOSE ESTUDO GENETICO DA SINDROME DE GILBERT ESTUDO GENETICO FIBROSE CISTICA (3 MUTACOES) HCV GENOTIPAGEM HCV QUALITATIVO PCR HIV GENOTIPAGEM HTLV 1 E 2 (WESTERN BLOT) MUTAÇÃO DELTA F508 P/ FIBROSE CÍSTICA - NEONATAL MUTAÇÃO V617F NO GENE JAK2 MTHFR - MUTAÇÃO GENE DA METILENOTETRAHIDROFOLATO PCR CHLAMYDIA PNEUMONIAE PCR DIAG. MOLECULAR PARA O VÍRUS DENGUE PCR HIV, QUANTITATIVO, CARGA VIRAL 101

59 Obrigado 127

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