Diagnóstico Microbiológico

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1 Diagnóstico Microbiológico Identificação e Tipagem Bacteriana Prof. Vânia Lúcia Diagnóstico clínico Sinais (mensuráveis) e sintomas (subjetivos) Origem Etiologia Natureza Diagnóstico laboratorial Identificação agentes envolvidos em patologias Suporte para o diagnóstico/tratamento clínico Investigação epidemiológica Investigação científica Prof. Cláudio 1

2 Microbiota indígena Monomicrobiana ORIGEM ETIOLOGIA Microbiota exógena Polimicrobiana Infecciosa NATUREZA Não-infecciosa Prof. Cláudio 2

3 A utilidade do resultado liberado pelo laboratório de microbiologia depende da qualidade da amostra recebida para investigação. A investigação baseia-se na construção de um estudo extremamente cuidadoso para a identificação correta de determinada espécie ou linhagem bacteriana. Linhagem microbiana: - Grupo de indivíduos, que de acordo com um sistema de identificação são indistinguíveis e podem ser diferenciados de outros grupos/indivíduos de uma mesma espécie em uma população. Prof. Cláudio 3

4 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRETO Pesquisa da presença de agentes causais de processos infecciosos em espécimes clínicos. Em termos gerais o diagnóstico direto pode ser feito de quatro formas diferentes: Cultivo de microrganismos em meio de cultura específicos; Visualização direta do patógeno por técnicas de microscopia; Detecção de antígenos específicos do patógeno. Estes métodos requerem a utilização de técnicas imunológicas ou de biologia molecular; Detecção de seqüências de ácidos nucléicos do patógeno pela utilização de sondas ou amplificação gênica; Prof. Cláudio 4

5 A visualização e o cultivo são, em geral, as técnicas mais utilizadas para se realizar diagnóstico microbiológico. São técnicas mais simples; Requerem menor infraestrutura; Tem menor custo. O diagnóstico microbiológico por cultivo dos microrganismos permite a recuperação do agente etiológico e sua utilização futura para estudos científicos Epidemiológicos; Susceptibilidade a drogas. Alguns microrganismos não podem ser visualizados ao microscópio óptico e outros não crescem em meios de cultivo. Neste caso, devemos nos ater aos métodos moleculares de diagnóstico ou às técnicas de diagnóstico indireto. As técnicas moleculares oferecem uma capacidade de discriminação muito maior além de seus resultados representarem dados mais precisos, apesar da necessidade de técnicos especializados. A detecção de antígenos e de ácidos nucléicos não permite recuperar células microbianas. Estas técnicas são mais eficientes na pesquisa de agentes não cultiváveis ou em concentrações muito baixas nos espécimes clínicos. Outra vantagem destas técnicas é sua rapidez. Apresentam um tempo de resposta muito menor do que as técnicas de cultivo porque não dependem do crescimento in vitro do patógeno. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRETO É possível diagnosticar uma infecção estudando-se o sistema imunológico do paciente pela pesquisa de anticorpos formados pela resposta imune específica. A pesquisa de anticorpos dirigidos a antígenos específicos de um dado microrganismo possibilita o diagnóstico de infecções crônicas ou agudas. Prof. Cláudio 5

6 Toda informação proveniente do serviço de microbiologia depende da qualidade do espécime. O diagnóstico incorreto pode ter conseqüências diretas no curso do tratamento adequado aos pacientes. Colheita incorreta, escassez, contaminação ou transporte deficiente - pode resultar em falhas na recuperação de patógenos predominantes ou responsáveis pelo processo infeccioso. OBSERVAÇÕES IMPORTANTES PARA O DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO: Preparo do paciente Seleção de sítio anatômico e natureza do espécime clínico Momento da coleta Amostragem do espécime número e quantidade Técnica de coleta: punção, swab, eliminação espontânea, aspirados, fragmentos de biópsia, etc Natureza do equipo de coleta e controle de população microbiana Armazenamento e transporte do material coletado Antibioticoterapia Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um "falso" agente etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível; Instruir claramente o paciente sobre o procedimento; Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos; Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado; Considerar o estágio da doença na escolha do material. Patógenos entéricos, causadores de diarréia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a fase aguda ou diarréica do processo infeccioso intestinal. Quantidade adequada de material deve ser coletada para permitir uma completa análise microbiológica; Opedidodo examedeveconterdadoscomoidade, doença debaseeindicaçãodo uso de antibióticos. Prof. Cláudio 6

7 CRITÉRIOS PARA AVALIAÇÃO DE SISTEMAS DE INVESTIGAÇÃO Aplicabilidade: possibilidade de resultado positivo Reprodutibilidade: deve-se repetir e dar sempre o mesmo resultado Poder discriminatório: capacidade de discriminação entre as linhagens. Facilidade de execução: infra-estrutura pessoal e material. As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou estruturais. Biotipagem(isolamento e identificação); Susceptibilidade a drogas antimicrobianas; Sorologia; Fagotipagem; Tipagem por bacteriocinas; Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting; Eletroforese multi-enzimática (MLEE multilocus enzime electrophoresis) Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia Prof. Cláudio 7

8 As técnicas clássicas de identificação microbiana são baseadas na presença ou ausência de determinantes fisiológicos como peculiaridades metabólicas ou estruturais. Biotipagem(isolamento e identificação); Susceptibilidade a drogas antimicrobianas; Sorologia; Fagotipagem; Tipagem por bacteriocinas; Perfil eletroforérico de proteínas celulares e Immunoblotting; Eletroforese multi-enzimática (MLEE multilocus enzime electrophoresis) Pesquisa de Reações de Hipersensibilidade Tardia BIOTIPAGEM Também utilizado para taxonomia bacteriana manual e automatizada. Princípio: o perfil de atividades metabólicas expressado por uma dada amostra bacteriana que inclui características como: Forma e arranjo celular; Fisiologia bacteriana (se anaeróbio ou aeróbio; se metaboliza carboidratos; tipo de produto final produzido, etc). Desvantagens: mutações ou mesmo condição fisiológica sob diferentes condições de estresse podem trazer resultados errôneos de tipagem e identificação. Prof. Cláudio 8

9 Prof. Cláudio 9

10 SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS - Muito utilizado nos centros de saúde para monitoramento dos níveis de resistência. - Alteração nos padrões susceptibilidade a drogas antimicrobianas pode ser indicativo da ocorrência de novas linhagens na comunidade e seu isolamento de vários pacientes pode ser considerado como primeiro indicativo de um surto. Princípio: Avaliação do perfil de susceptibilidade a drogas clinicamente importantes. Prof. Cláudio 10

11 SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS Desvantagens: A ausência da pressão seletiva dos antimicrobianos pode resultar em perda dos marcadores de resistência; Os mecanismos de recombinação genética bacteriana permitem a troca de marcadores de resistência em diferentes circunstâncias, o que dificulta a determinação desses marcadores. Resistência cruzada a diferentes drogas antimicrobianas leva a uma identificação equivocada dos marcadores. SOROLOGIA - Este método tem sido largamente utilizado na identificação microbiana, sendo uma das ferramentas clássicas para os estudos epidemiológicos. Princípio: baseados na observação de que microrganismos de mesma espécie podem expressar diferentes determinantes antigênicos na superfície. Variadas estruturas da superfície apresentam propriedades antigênicas, como: Lipopolissacarídeo (LPS); Polissacarídeo capsular; Proteínas de membrana; Estruturas extracelulares (flagelos e fímbrias) Prof. Cláudio 11

12 A determinação isolada de anticorpos específicos oferece pouca informação porque qualquer contato com antígenos vai desencadear sua produção. Para se estabelecer um diagnóstico sorológico confiável é necessário comparar-se a quantidade de anticorpos em períodos distintos do processo infeccioso Como outros métodos, a sorologia está sujeita a erros Em alguns casos a presença de anticorpos circulantes indica que certa pessoa esteve em contato com um agente infeccioso e não, necessariamente, apresenta uma doença. Janela imunológica - causa freqüente de falsos negativos: período compreendido entre o contato com o agente infeccioso, seu reconhecimento pelo sistema imunológico e a produção de anticorpos específicos. Reações cruzadas podem ser a causa de falsos positivos. anticorpos - Estruturas antigênicas semelhantes podem favorecer o reconhecimento inespecífico de antígenos. Imunossupressão pode induzir uma queda ou inibição da resposta imune específica impedindo a detecção de anticorpos mesmo durante uma doença infecciosa. SOROLOGIA -Várias são as técnicas disponíveis para os ensaios sorológicos, como: Reações antígeno-anticorpo; Soroaglutinação; Aglutinação de partículas; Neutralização Marcação enzimática; Fluorescência; Aplicação de anticorpos monoclonais, etc. Desvantagens: - Técnicas sorológicas exigem um grande controle de qualidade nos reagentes desde sua pureza e as soluções preparadas. - Considerando-se células bacterianas, estas técnicas podem apresentar um baixo poder discriminatório devido à diversidade de determinantes antigênicos em uma mesma população bacteriana. Prof. Cláudio 12

13 Aplicabilidade de técnicas moleculares no diagnóstico microbiológico Técnicas de diagnóstico molecular, geralmente caras, não devem ser usadas no lugar de técnicas convencionais que são reconhecidamente rápidas, sensíveis, reprodutíveis e que possuem um alta relação custo-benefício. A decisão por um diagnóstico molecular deve levar em consideração principalmente o impacto da técnica na prática clínica e a economia de gastos associados à intervenção e para o paciente. A detecção rápida de bactérias multirresistente pode resultar em um isolamento mais rápido do paciente, terapia mais apropriada e diminuição da infecciosidade do paciente. Prof. Cláudio 13

14 Contenção do espalhamento da infecção diminuição do tempo de morbidade do paciente + = custo-benefício da utilização de técnicas moleculares para diagnóstico Apesar de toda rapidez e sensibilidade, o diagnóstico molecular não pode substituir os métodos culturais e sorológicos convencionais em todos os momentos. Os resultados do diagnóstico molecular e dos métodos culturais e sorológicos têm significado diferente. A detecção ou amplificação de ácidos nucléicos determinam se existe DNA ou RNA de um organismo particular em uma amostra biológica Não revela dados sobre a viabilidade do organismo Não diz se um microrganismo está envolvido em um processo infeccioso Permite avaliar a clonalidade dos diferentes organismos e permite avaliação de surtos e geração de conhecimento epidemiológico Prof. Cláudio 14

15 Prof. Cláudio 15

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