Isolamento e identificação de bactérias do gênero Staphylococcus

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1 Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais Objetivos Isolamento e identificação de bactérias do gênero Staphylococcus Apresentar aos alunos uma técnica para isolamento e identificação de bactérias do gênero Staphylococcus. Materiais Placas de Ágar hipertônico manitol; Tubos com plasma de coelho citratado diluído 1:10; Placas de ágar DNAse; Tubos de caldo tioglicolato; Frascos com solução de HCl 1N; Bateria de corantes para coloração de Gram; Zaragatoas estéreis; Lâminas para microscopia. Execução Etapa 1 Identificar os tubos e as placas corretamente, com o nome do aluno ou do grupo e a data. Usando-se zaragatoas estéreis, coletar material da mucosa da nasofaringe (Fig. 1) e da orofaringe (Fig. 2); Semear o material coletado no meio caldo tioglicolato e no meio ágar hipertônico manitol, empregando o método de esgotamento (Fig. 3) e encubar as amostras a 37 C por 24 horas. Fig. 1 Coleta de material superficial da mucosa da nasofaringe com zaragatoa estéril. Fig. 2 Coleta de material superficial da mucosa da orofaringe com zaragatoa estéril. Fig. 3 Semeadura do material coletado pelo método de esgotamento em meio ágar hipertônico manitol. 1

2 Etapa 2 Observar o crescimento bacteriano no tubo de caldo tioglicolato, indicado pela turbidez do meio (Fig. 4) e nas placas de ágar hipertônico manitol, através da mudança da coloração rósea para amarelada (Fig. 5); Caracterização morfológica: O simples crescimento em meio seletivo indicador não permite tirar qualquer conclusão quanto à espécie bacteriana presente no material, havendo, portanto a necessidade da realização de mais teste para a identificação no nível de espécie. Preparar o esfregaço a partir das colônias crescidas em meio tioglicolato e Agar hipertonico manitol (halo amarelo) e proceder com a coloração de Gram; Coloração de Gram: Colocar uma alça de soro fisiológico numa lâmina limpa e fazer um esfregaço fino a partir da colônia suspeita de ser do gênero Staphylococcus (você poderá fazer também de outras colônias que cresceram no meio). Corar pelo método de Gram e observar a morfologia microscópica da colônia. Fig. 4: Crescimento bacteriano em tubo com meio tioglicolato, observado pela turbidez. Fig. 5: Crescimento bacteriano observado meio em Ágar hipertônico manitol. Este meio é indicado para isolamento de linhagens representativas de Staphylococcus. A mudança de cor de róseo para amarelo indica o crescimento de colônias de bactérias manitol positivas. Etapa 3 Caracterização fisiológica (provas de patogenicidade): comprovada a morfologia característica do gênero Staphylococcus, deve-se prosseguir na determinação das características fisiológicas inerentes à espécie através das provas de patogenicidade, descritas a seguir: Prova de coagulase: havendo crescimento de colônias manitol positivo, transferir uma delas para um tubo com plasma de coelho citratado diluído na proporção 1:10, fazendo uma suspensão homogênea (Fig. 6). Incubar a 37 C por 3 horas. A leitura feita com mais de 3 horas de incubação pode dar resultado falso-negativo, pois a bactéria produz enzimas que desfazem o coagulo. Para evitar tal causa de erro, os tubos, após este período, serão mantidos a 4 C. Prova de DNAse: semear com alça de platina, em movimentos circulares, as colônias suspeitas, na superfície de uma placa de ágar DNAse (Fig. 7). Identificá-la e incubá-la a 37 C por 24 horas. 2

3 Fig. 6: Colônias provenientes do ágar hipertônico manitol foram transferidas para um tubo contendo plasma de coelho, para o teste de coagulase. Fig. 7: Colônias provenientes do ágar manitol foram transferidas para uma placa de ágar DNAse, para a prova de DNAse. Leitura e interpretação 1. Crescimento em meio de tioglicolato 1.1. Leitura Retirar o tubo de tioglicolato da estufa e observar o crescimento do micro-organismo (turvação do meio e/ou presença de grumos na camada aeróbica); 1.2. Interpretação O caldo Tioglicolato é um meio de enriquecimento, pois incrementa o crescimento de certas espécies bacterianas ao mesmo tempo em que inibe o crescimento de micro-organismos que não sejam de interesse. O tioglicolato de sódio é um agente redutor que se combina com o oxigênio dissolvido residual, eliminando essa forma do meio. Sendo assim, o tubo apresenta diferenças de disponibilidade de oxigênio da superfície ao fundo. Na superfície, em contato com o oxigênio atmosférico há o crescimento de bactérias aeróbias, na parte mediana do tubo, crescem bactérias microaerófilas e do meio até o fundo do tubo há o desenvolvimento de bactérias anaeróbias. Portanto, nesta prática, há predominância de crescimento das bactérias Staphylococcus na superfície, apresentando um aspecto macroscópico de neve ou algodão, enquanto no meio até no fundo do tubo há o crescimento das bactérias do gênero Streptococcus, apresentando um aspecto de raios (Fig. 4). 2. Crescimento bacteriano em ágar hipertônico manitol 2.1. Leitura Diferenciar as colônias quanto à pigmentação: cor branca ou amarela; Observar se houve modificação da cor do meio de cultura, de róseo para amarelo, devido a viragem do indicador de ph (vermelho de fenol), resultante da fermentação do manitol. Quando não há fermentação do manitol o meio permanece inalterado (manitol negativo) Interpretação O ágar hipertônico manitol é um meio de cultura seletivo, no qual crescem apenas bactérias 3

4 halofilas, ou seja, que suportam grande concentração de sal. Além disso, é um meio diferencial, pois possui indicador de ph vermelho de fenol, que se torna vermelho em meio básico e amarelo em meio ácido. Dessa forma, é possível identificar espécies fermentadoras de manitol, que liberam no meio, produtos ácidos da fermentação, tornando o meio amarelo, como é o caso de algumas espécies de Staphylococcus. Portanto, a degradação do manitol é um indicativo da presença de Staphylococcus aureus. Cerca de 20 a 80% da população apresenta Staphylococcus aureus em sua microbiota normal da cavidade nasal como mostra o Quadro 1, como pode ser ilustrado na figura 8, que mostra a porcentagem de alunos de uma turma que apresentaram o resultado positivo para o teste de manitol. Quadro 1: Microbiota normal da cavidade nasal 1. Difteróides 2. Staphylococcus epidermidis 3. Staphylococcus aureus (20 a 80% da pop.) 4. Streptococcus pneumoniae (5 a 15% da pop.) 5. Haemophilus influenzae (5 a 10 % da pop.) 6. Neisseria sp. (0 a 15% da população) 7. Nesseria meningitis (0 a 4% da pop.) 8. Streptococcus 9. Klebsiella spp 10. Enterobacter spp 11. Acinetobacter (0 a 1% da pop.) Fig. 8: Porcentagem de alunos de uma turma que apresentaram resultado positivo para o teste de degradação do manitol Fig. 9: À direita observa-se o resultado negativo para a prova de coagulase, enquanto à esquerda pode- -se observar a coagulação do meio que caracteriza o resultado positivo para a prova de coagulase. Fig. 10: Formação de um halo transparente em torno do crescimento bacteriano, o que caracteriza o resultado positivo para a prova de DNAse. 4. Prova de coagulase 4.1. Leitura A prova se caracteriza pela formação de um coágulo firme no resultado positivo. Em caso negativo, o plasma continua líquido (Fig. 9) Interpretação: Staphylococcus aureus são bactérias produtoras de coagulase que desencadeiam os mecanismos de coagulação do meio externo para se defenderem. O Teste de coagulase é utilizado para sinalizar a liberação dessa enzima no sangue/plasma pelas bactérias. 4

5 5. Prova de DNAse 5.1. Leitura Cobrir a superfície do meio com uma solução de HCl 1N. A prova positiva se caracteriza pela formação de um halo transparente em torno do crescimento bacteriano (Fig. 10), devido à degradação do DNA pela DNAse produzida pelo Staphylococcus aureus. Na prova negativa, o halo não é formado, devido a não produção de DNAse pelos micro-organismos Interpretação O teste de DNase é usado para detectar a degradação do Ácido desoxirribonucleico (DNA), contido no meio de cultura, por bactérias que possuem uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease, responsável pela reação. A enzima quebra o DNA em subunidades compostas de nucleotídeos. O teste é útil para diferenciar Serratia do gênero Enterobacter; Staphylococcus aureus de estafilococos coagulase negativa e Moraxella catarrhalis de espécies de Neisseria. Ao utilizarmos o meio de DNAse Test Agar, devemos acrescentar uma quantidade de HCl para revelar a atividade enzimática. Uma zona clara em volta da colônia indica reação positiva. Caso não haja atividade dessa enzima o HCl reagirá com o ácido nucléico intacto, formando um precipitado branco. Resultados Comparar e diferenciar as espécies de Staphylococcus isoladas de acordo com o quadro abaixo: Quadro 2: Resultado das provas de patogenicidade entre espécies de Staphylococcus Staphylococcus Manitol Coagulase DNAse Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyiticus +/

6 Literatura recomendada PELCZAR, Jr.; JOSEPH, Michael. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2ª Ed. São Paulo: Makron Books, TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 8ª ed. Porto Alegre: Artmed, KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.