Investigação Fitoquímica e Isolamento da Substância Antibacteriana Presente na Espécie Ananas erectifolius (curauá)

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1 Investigação Fitoquímica e Isolamento da Substância Antibacteriana Presente na Espécie Ananas erectifolius (curauá) Helen Cristiane Araújo Souza 1, Wagner L. R. Barbosa 1, José Maria Vieira 2 1 Laboratório de Fitoquímica, 2 Laboratório de Microbiologia, Departamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará. Bolsa PIBIC/CNPQ.CEP: , Belém-PA, tel: (091) , barbosa@ufpa.br RESUMO O Ananas erectifolius é uma Bromeliácea ainda pouco conhecida, sabe-se, no entanto de seu uso popular na cicatrização de lesões cutâneas. Este trabalho tem por objetivo propiciar informações sobre a espécie e investigar seus constituintes químicos e propriedade antibacteriana contra cepas de Sthaphylococcus aureus. O extrato etanólico bruto foi fracionado por partição sólido-líquido com hexano, acetato de etila e metanol. As frações foram submetidas à CCD para determinação de seu perfil cromatográfico e à bioautografia para análise da atividade antibacteriana. O isolamento da substância ativa a partir da fração hexânica foi realizada em coluna LoBar de gel de sílica de fase normal utilizando o sistema CLAE a baixa pressão (até 6 bar). Após o isolamento do componente ativo procedeu-se nova bioautografia, a fim de confirmar a atividade da substância ativa. Esta substância ativa foi utilizada como referência em experimentos posteriores. A fim de se identificar quimicamente o componente ativo do vegetal procedeu-se ao preparo e fracionamento em coluna de uma nova partida de extrato etanólico, com monitoramento de atividade, obtendo-se uma fração rica em substância ativa. ABSTRACT 1-INTRODUÇÃO O Ananas erectifolius é uma Bromeliácea pertencente ao gênero Ananas e popularmente conhecida como curauá [1]. O pó de curauá é utilizado na medicina popular para a cicatrização de lesões cutâneas [2], enquanto que suas fibras podem ser utilizadas para a fabricação de papel, na produção de componentes para bancos e revestimento de automóveis [3], além de ser empregadas para confecção de cordas e barbantes [4]. Existem duas variedades de Curauá: o roxo e o branco (Fig.1). A variedade branca foi utilizada para a realização deste trabalho (Fig.2). 2- Objetivos Produzir informações a cerca da espécie; Determinar o perfil fitoquímico e cromatográfico da fração hexânica e do extrato etanólico bruto; Avaliar, isolar e identificar o componente com atividade antimicrobiana presente na fração hexânica.

2 3- Material Vegetal O material vegetal foi coletado na Empresa Brasileira da Amazônia Oriental (EMBRAPA), onde procedeu-se a caracterização do exemplar no laboratório de Botânica pela Dr. Silvane Tavares Rodrigues. Fig.1: Variedades branca e roxa Fig.2: variedade branca 4.1- PREPARAÇÃO DO EXTRATO 4- METODOLOGIA O material vegetal fresco coletado pesou 1,4 Kg, foi lavado, fragmentado, seco a sombra e a temperatura ambiente (27 ºC) por 3 semanas, por fim foi levado à estufa a 50ºC por 2 dias. Após a secagem, o material vegetal foi triturado com etanol, usando-se para isso 2L do solvente. O material foi submetido à maceração por 6 dias, após o que foi filtrado, resultando no extrato etanólico, que foi concentrado, obtendo-se o extrato etanólico bruto seco (EEB), para ser usado na abordagem fitoquímica e na cromatografia em camada delgada ABORDAGEM FITOQUÍMICA DO EXTRATO BRUTO E DA FRAÇÃO HEXÂNICA A abordagem fitoquímica do EEB e da fração hexânica dele obtida foi realizada para que se pudesse estabelecer uma comparação quanto aos compostos presentes tanto no EEB quanto na FHex. Os testes realizados foram baseados no Manual para Análise Fitoquímica e Cromatografia de Extratos Vegetais (2001) [5] e avaliou a presença dos seguintes metabólitos secundários: Ácidos Orgânicos, Açúcares Redutores, Alcalóides, Antraquinonas, Carotenóides, Catequinas, Esteróides e Triterpenóides, Fenóis e Taninos, Flavonóides, Polissacarídeos Proteínas e Aminoácidos e Saponina Espumídica PARTIÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO O EEB foi fracionado por partição sólido-líquido, lavando-se o extrato com 45 ml de hexano. O filtrado foi recolhido e posteriormente concentrado.

3 Através desta técnica foi possível obter a fração hexânica, que depois foram submetidos a CCD e a bioautografia ANÁLISE CROMATOGRÁFICA A cromatografia é um método moderno de análise que permite efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas por si mesma ou em conjunto com outras formas instrumentais de análise [7] Determinação do perfil da Fração Hexânica e do Extrato Etanólico Bruto por Cromatografia em Camada Delgada Para realização da cromatografia foram utilizadas cromatoplacas padronizadas (Merck ) e placas manufaturadas de fase normal. O extrato etanólico bruto e a fração hexânica foram redissolvidas com clorofórmio, e foi aplicada sobre as placas a 1cm da borda inferior e 0,5 cm da borda lateral. As fases móveis utilizadas na cromatografia foram respectivamente hexano/acetona (80:20), clorofórmio/metanol (90:10) e clorofórmio/metanol/água (75:20:05), as quais foram empregadas separadamente. Após o desenvolvimento dos cromatogramas, as placas foram secas e reveladas. Os reveladores utilizados foram anisaldeído/ácido sulfúrico, solução de ácido sulfúrico 10% em etanol e cloreto férrico 10% em etanol Bioautografia Para verificar a atividade antibacteriana da fração hexânica, esta foi submetida à bioautogarafia. A bioautografia consiste na aspersão de uma suspensão de microorganismos, no caso presente Staphylococcus aureus, sobre um cromatograma, no qual avalia-se a zona de inibição, se houver, à luz natural ou após a aplicação de um corante [6]. Neste trabalho o corante utilizado foi eosina na concentração de 2mg/mL. Para preparar o inóculo de S. aureus, utilizou-se o seguinte procedimento: com o auxílio da alça de platina transferiu-se algumas colônias, para um tubo contendo 3 ml de caldo Müller-Hinton. Incubou-se por 24 horas à 35 ºC (utilizando-se como base a escala de Mac Farland para verificar a turvação no tubo que deveria estar entre 0,5 e 1,0 da referida escala). Quando necessário, fez-se diluição da suspensão com caldo Müller-Hinton, até a obtenção da turvação desejada. A placa cromatografada foi borrifada com suspensão de cepas ativas de S. aureus, acondicionada em placa de petri, e incubada por um período de 24 horas. Em seguida, a placa foi corada com eosina (2mg/mL). A inibição do crescimento foi indicada por zona de clareamento no cromatograma.

4 Cromatografia em Coluna A fração hexânica foi submetida à cromatografia em coluna, utilizando-se gel de sílica como fase estacionária e clorofórmio e metanol, que foram misturados para compor 500 ml de fase móvel, na proporção de 97:3. A fração hexânica foi dissolvida numa quantidade mínima de clorofórmio e aplicada com auxílio de uma pipeta Pasteur no topo da coluna de adsorvente. As frações, reunidas após análise cromatográfica (CCD), foram submetidas à análise biológica (bioautografia) para a localização de componentes ativos. Após esta etapa, as frações ativas foram novamente cromatografadas em coluna, para o isolamento do componente ativo Isolamento do componente ativo da Fração Hexânica por Cromatografia Líquida de Baixa Pressão (Lo Bar ) O isolamento foi realizado por Cromatografia Líquida de Baixa Pressão, usando-se uma coluna LoBar acoplada à bomba do Sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. - Método Preparativo para Isolamento de Frações de EEB de Ananas erecifolius. O equipamento utilizado nas análises foi o sistema MERCK HITACHI com Detetor de Arranjo de Diodo (DAD). A parte física do equipamento é composta por uma bomba dupla modelo L-7100 dotada de quatro canais, um forno de coluna L-7300, DAD L-7455 e interface D-7000, além de um organizador de solventes. A retirada de ar dos solventes é feita por um degaseificador de solventes modelo L-7612, antes da mistura e da entrada deles na coluna. A coluna usada foi uma LoBar Lichroprep SI 60. Todo o equipamento é gerenciado pelo software HPLC SISTEM MANAGER que comanda o processo automaticamente, analisa o resultado, que é apresentado sob a forma de cromatogramas e espectros das substâncias separadas na coluna. Neste experimento utilizou-se a bomba, o organizador de solventes e o degaseificador. A amostra foi aplicada na concentração 83mg do extrato hexânico por ml. Como as substâncias em questão são de polaridade muito baixa, o eluente utilizado na análise foi CHCl3/MeOH em gradiente de 1% a 2% de MeOH em 4 minutos e isocrático a 2% por mais 130 minutos e após o que a coluna foi lavada com CHCl3 /MeOH em partes iguais Análise da fração hexânica por CLAE A fração não possui substâncias que reajam à radiação ultravioleta do detetor; passíveis de serem utilizadas como marcadores químicos.

5 5- RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1- RENDIMENTO DO EXTRATO - 189,84 g de droga seca forneceu 4,67 g de EEB, observando-se que o rendimento foi de 2,46% RENDIMENTO DAS FRAÇÕES Os rendimentos das frações foram obtidos em relação à massa de extrato etanólico bruto, conforme mostra a tabela 1. Tabela 1: Frações e seus respectivos rendimentos. FRAÇÕES FHex FAcOEt FMeOH RENDIMENTO (%) 27,41 4,50 47, ABORDAGEM FITOQUÍMICA A prospecção fitoquímica foi realizada em triplicata de amostras na concentração de 5mg/mL. Os testes realizados foram baseados no Manual para Análise fitoquímica e Cromatográfica de Extratos vegetais (2001) [5] e avaliou a presença dos seguintes metabólitos secundários: Ácidos Orgânicos, Açúcares Redutores, Alcalóides, Antraquinonas, Carotenóides, Catequinas, Esteróides e Triterpenóides, Fenóis e taninos, Flavonóides, Polissacarídeos, Proteínas e Aminoácidos e Saponina Espumídica. Tabela 2: Abordagem Fitoquímica Classes Metabólicas EEB FHex Açúcares Redutores Positivo Positivo Carotenóides - Positivo Depsídeos e Depsidonas - Indicativo Esteróides e triterpenóides - Positivo Fenóis e Taninos Positivo DETERMINAÇÃO DO PERFIL CROMATOGRÁFICO DA FRAÇÃO HEXÂNICA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD). Análises cromatográficas foram realizadas com os eluentes hexano/acetona (80:20), clorofórmio/metanol (90:10), e clorofórmio/metanol/água (75:20:05), sobre gel de sílica normal, procedendo-se em seguida a revelação dos cromatogramas com anisaldeído sulfúrico. Verificou-se que o melhor eluente para a separação das substâncias foi CHCl3/MeOH (90:10), que posteriormente foi ajustado para a realização da bioautografia. A bioautografia consiste na aspersão de uma suspensão de microorganismos, no caso presente Staphylococcus aureus, sobre um cromatograma, no qual avalia-se a zona de inibição, se houver, à luz natural ou após a aplicação de um corante [6]. Neste trabalho o corante utilizado foi eosina na concentração de 2mg/mL.

6 Bioautografia Fase móvel: CHCl3/MeOH (97:3) Concentração: 40 mg/ml Fig.3 :Bioautografia das frações hexânica, acetato de etila, metanol e EEB, antes e após a aplicação do corante (eosina) CROMATOGRAFIA EM COLUNA DA FRAÇÃO HEXÂNICA Frações reunidas de acordo com seu perfil cromatográfico. Cromatografia em coluna por via úmida [ 7] de 550mg da FHex; CCD e revelação com etanol a 10% de H 2 SO 4 das frações obtidas; Tabela 3: Massa e rendimento das frações obtidas por Cromatografia em Coluna da Fhex Frações A B C D E F G H I J Total Massa (mg) 158,20 6,20 13,20 102,30 77,80 9,80 7,50 24,10 98,80 26,50 524,40 Rendimento (%) 28,76 1,12 2,40 18,60 14,14 1,78 1,36 4,38 17,96 4,81 95,31 Bioautografia - Hex/acetona (4:1)- A, D, E, F, G - CHCl3/MeOH (95:5)- B, C, H, I, J - Atividade: D, E, F, G, H - Determinação do perfil das frações D, E, F e FHex (Fig.4) - Bioautografia das frações D e E. Presença de halos inibitórios antes da borrifação da eosina.(fig.5)

7 Fig.4: CCD das Frações Fig.5: Bioautografia das Frações. Uso do reativo Liebermann-Bouchard [ 8] - Teste das frações D e E quanto à presença de Terpenóides (Fig.6). Rf 0, ISOLAMENTO DO COMPONENTE ATIVO DA FRAÇÃO HEXÂNICA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE BAIXA PRESSÃO (LOBAR ). - 80mg da fração D foi dissolvida em eluente (CHCl 3 /MeOH), e aplicada em coluna LoBar. Tabela 4: Massa e rendimentos das frações obtidas após isolamento do componente ativo. Frações Massa (mg) Rendimento (%) 1 34,00 40,62 2 1,00 1, ,90 16,60 4 7,50 8,96 5 1,70 2,03 Total 58,10 69,04 Bioautografia das frações 3 (D), 4 (D), E, F, G e H (Fig.7) Fig.7:Frações bioautografadas antes e após a aplicação do corante.

8 Tabela 5: Frações bioautografadas e seus respectivos Rf s Frações 3(D) 4(D) E F H Rf s 0,90 0,90 0,89 0,30 0,42 Ajustou-se a polaridade da fase móvel, utilizando-se hexano/acetona (4:1), e procedeu-se a CCD, revelação com iodo (Fig.9) e a bioautografia (Fig.10) com a substância isolada e com as demais frações que apresentaram atividade, o que proporcionou a visualização de um halo de inibição com Rf 0,4. Atualmente a substância ativa encontra-se em fase de purificação através do fracionamento por Cromatografia em Camada Delgada Preparativa. CONCLUSÃO O isolamento da substância responsável pela atividade antibacteriana do curauá foi realizado utilizando-se a técnica de Cromatografia Líquida em Baixa Pressão. A atividade antimicrobiana do curauá está presente nas frações D, E, F, H da fração hexânica, e a substância ativa foi isolada nas frações 3 e 4 oriundas da fração D. Análises com a fração hexânica demonstraram que o melhor eluente para separação dos constituintes químicos foi clorofórmio/ metanol (97:3). A determinação do perfil desta fração foi determinada pelas técnicas de bioautografia e cromatografia em coluna. Após o isolamento a fase móvel foi ajustada para hexano/acetona (4:1) para a realização da bioautografia. Quanto a composição química do extrato de curauá, pode-se detectar a presença de açúcares redutores, carotenóides, esteróides e triterpenóides, fenóis, taninos e indicou a presença de depsídeos e depsidonas. PALAVRAS CHAVES Ananas erectifolius,isolamento, Investigação Fitoquímica AGRADECIMENTOS À instituição Universidade Federal do Pará, e ao Pibic/CNPq REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- LEDO, I.A. de M. O cultivo do curauá no lago grande de Franca. Belém: BASA, p. apud LAMEIRA, O.A.; COSTA, M.R.; YOSHINO,V.C. BIOTECNOLOGIA. Ciência & Desenvolvimento. Ano V número 26, maio/junho 2002, p FURTADO, E.C.C. Investigação fitoquímica com monitoração de extrato e frações de Ananas erectifolius. Belém, Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia)- Centro de Ciências da Saúde, Univedrsiadde Federal do Pará. 3- FUJIHASHI, G.A. & DINIZ, M.C.B. Ananas erectifolius (curauá): Padronização do extrato, frações e do material vegetal. Belém, Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará.

9 4- BARROS, M.C. C & SILVA, S.M. Curauá (Ananas erectifolius). Belém, Monografia (Graduação em Farmácia)- Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará. 5- BARBOSA, W.L.R. et al. Manual para Análise fitoquímica e Cromatografia de Extratos Vegetais. Edição revisada, Belém, COLLINS, et al. Introdução a métodos cromatográficos. UNICAMP, 7ª ed., São Paulo, p.65,68,185, MARTINI, M & ELOFF, J.N. The preliminary isolation of several antibacterial compounds from Combretum erythrophyllum (Combretaceae). Journal of Ethnopharmacology 62 (1998), p WAGNER, H., BLADT,S. Plant Drug Analysis- A Thin Layer Cromatography Atlas- 2nd Editon 1996.