TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

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1 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

2 Técnicas cromatográficas Termo cromatografia são atribuídos ao botânico Mikhael Tswett, em Chrom cor Graphe escrever Reed (Inglaterra) e Day (EUA) Petróleo Época Moderna da Cromatografia, 1930 Martin e Synge, 1941, descreveram a cromatografia líquida Prêmio Nobel de 1952

3 Técnicas cromatográficas Cromatografia: É um método físico-químico de separação de componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes em duas fases, que estão em contato íntimo. Separação Analisar Identificar Mistura de compostos Compostos Purificar Quantificar

4 Técnicas cromatográficas Baseia-se na partição do soluto entre duas fases: Fase estacionária Fase que não se move junto com a amostra Fase móvel Gás ou líquido que se move junto com a amostra

5 Técnicas cromatográficas Fase estacionária FM FM FM DETECTOR

6 Técnicas cromatográficas Classificação pela técnica Planar Em coluna

7 Tipos de interações cromatográficas Fenômenos responsáveis pela separação Adsorção Partição FM x FE

8 Tipos de interações cromatográficas FM x FE Troca iônica Bioafinidade Exclusão

9 Cromatografia em camada delgada CCD TLC thin layer chromatography O que analisar? Substâncias orgânicas e inorgânicas Vantagens: Fácil compreensão e execução Separação em um breve espaço de tempo Versatilidade Repetibilidade Baixo custo

10 Cromatografia em camada delgada Procedimento: 1º Passo

11 Cromatografia em camada delgada Procedimento: 2º Passo Aplicação

12 Cromatografia em camada delgada Procedimento: 3 Passo Cuba cromatográfica Desenvolvimento Frente da fase móvel

13 Cromatografia em camada delgada Procedimento: 4º passo Calculo do Rf Fator de retardamento Rf = cm percorrido pelo analito cm percorrido pelo solvente Rf - Padronizado

14 Cromatografia em camada delgada Reveladores e agentes cromogênico Resolução

15 Características da placa de CCD Principais adsorventes (FE): Silica (SiO2) Caráter fracamente ácido Vários tipos (Merck) Celulose Uso na separação de nucleotídeos, ácidos nucléicos e proteínas Alumina (Al2O3) Características básica, neutra ou ácida Terra diatomácea Neutro Menos adsorvente e menor resolução que a sílica Outras: silicato de magnésio, C18, polímeros (SDB)

16 Características da placa de CCD Preparadas em laboratório Pré fabricadas Custo mais elevado São mais uniformes Melhora a separação Rf mais reprodutível Ativação da placa de CCD Consiste no aumento da resolução com o aquecimento da placa antes do uso Sílica, alumina e terra diatomácea C por 30 a 60 minutos 105 C por 10 minutos

17 Seleção da fase móvel Série eulotrópica de Wohlleben Aumento do poder de eluição (polaridade crescente) N-pentano Éter de petróleo N-hexano N-heptano Ciclohexano Tetracloreto de carbono Tricloroetileno Benzeno Diclorometano Clorofórmio Éter etílico Acetato de etila Piridina N-butanol Acetona Isopropanol Etanol Metanol Água

18 FM X FE Sistema de distribuição dos analitos entre a FM e a FE: Fase normal FE é mais polar que a FM Fase reversa FE é menos polar que a FM

19 Quantidade do analito Técnica CCD Aplicação das amostras Quantidade da substância aplicada 0,1 1 5% Rf 0,3 0,2 0,1 0,1 0, mcg

20 Técnica CCD Revelação identificação - detecção Técnicas de revelação: Métodos físicos Luz ultravioleta Placas com indicadores fluorescentes a um determinado comprimento de onda Substâncias não destruídas Métodos químicos Técnica do banhado Pulverização São irreversíveis

21 Técnicas de CCD Análises qualitativa Baseia-se no Rf Valor do Rf em livros de referência e artigos Reprodutibilidade do Rf Qualidade do adsorventes Grau de atividade da camada e a umidade do ar Qualidade dos eluentes Saturação da cuba Temperatura Quantidade da substância aplicada

22 Técnica CCD Análise quantitativa Parte do princípio que as amostras devem ser aplicadas quantitativamente: Microserringas graduadas Microdosadores automáticos Desaga Camag

23 Cromatografia gasosa Técnica Fase móvel Fase estacionária Em coluna Gasosa líquida sólido Cromatografia gasosa fase ligada GC gas chromatography CG

24 Cromatografia gasosa O que analisar? Compostos voláteis de pontos ebulição de até 350 o C e pesos moleculares menores que 500. Compostos que possam produzir derivados voláteis. Compostos termicamente estáveis nas condições de trabalho.

25 Cromatografia gasosa

26 Cromatografia gasosa Instrumentação - detector

27 Cromatografia gasosa Instrumentação - detector Um detector é um dispositivo que percebe a presença de um dispositivo diferente daquela do gás de arraste e converte essa informação para um sinal elétrico

28 Cromatografia gasosa Instrumentação - detector FID ECD Características dos detectores: Sensibilidade: é a resposta por quantidade de amostra, que é a inclinação da curva resposta/quantidade. A mínima quantidade da curva é definida como o nível mínimo detectável (MDL). NPD Seletividade: é uma medida que uma categoria de compostos deve dar como resposta ao detector.

29 Cromatografia gasosa Instrumentação - detector Principais características do detector: Resposta rápida Uma grande faixa de resposta linear. Alta sensibilidade. Estabilidade de operação. Facilidade de uso. Baixa manutenção. Baixo custo.

30 Detectores

31 Cromatografia líquida de alta eficiência HPLC High Performance Liquid Chromatography CLAD Cromatografia líquida de alto desempenho CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência Técnica Fase móvel Fase estacionária Em coluna Líquida líquida sólido Cromatografia líquida fase ligada

32 Cromatografia líquida clássica e de alta eficiência Cromatografia líquida clássica Cromatografia líquida de alta eficiência bomba bomba bomba

33 HPLC - aplicação É utilizada na análise de compostos não voláteis ou instáveis termicamente. Exemplo de campos de aplicação: Indústria Alimentos Tintas Química Clínicas Farmacêutica Analitos Açúcares, ácido ascórbico, aminoácidos, parabenos, proteínas Resinas, tensoativos, Polímeros Metabólitos, proteínas, aminoácidos Princípios ativos

34 HPLC - Instrumentação injetor bomba Coluna reservatório Registro de dados Detector

35 HPLC Instrumentação coluna Técnica Fase móvel Fase estacionária Em coluna Líquida líquida sólido Cromatografia líquida fase ligada Cromatografia Exemplos Líquida-Líquida Líquida-Sólida Líquida-Fase ligada Etilenodiamina, polietileno, polisiloxano, polibutadieno Sílica e alumina C18, C8, cianopropil, diol, aminopropil, fenil, polietileno, aminas quartenárias, etc.

36 HPLC Instrumentação detector UV visível Fluorescência Índice de refração Infravermelho Eletroquímico Espalhamento de luz Espectrometria de massa

37 Técnicas cromatográficas Fator GC HPLC Amostra Tipo de amostra Amostra ou derivado volátil, termicamente estável Gases,líquidos e sólidos Amostra solúvel na fase móvel Líquidos e sólidos Capacidade analítica Separação de até 200 analitos Separação de até 100 analitos Grau de dificuldade de manuseio Relativamente fácil Requer maior tempo

38 Espectrometria de massa Detector utilizado em cromatografia gasosa e cromatografia líquida; A espectrometria de massa (EM) é uma técnica largamente utilizada na análise de moléculas de diversas massas molares (μg-pg). É uma técnica destrutiva. A grande sensibilidade do método faz com que seja rotineiramente usado na análise de substâncias em baixa concentração, como no caso do doping, controle de alimentos e medicamentos, contaminação ambiental, entre muitas outras aplicações.

39 Espectrometria de massa Vantagens: Alto grau de especificidade Técnica inequívoca de identificação - confirmação Desvantagens: Requer etapa de extração da amostra Maior tempo de análise Equipamento de alto custo Necessidade de profissional altamente especializado

40 Espectrometria de massa LENTES 3) ANALISADOR ) ENTRADA GC OU HPLC 4) DETECTOR DE MASSA 2) IONIZAÇÃO (FONTE DE ÍONS) Esquema geral de um espectrômetro de massa

41 Espectrometria de massa Fonte de ionização: impacto de elétrons Cloroetano CH 3 CH 2 Cl CH 3 CH 2 Cl m/z 64 CH 3 (loss of 15) CH 2 Cl m/z 49 CH 3 CH 2 Cl m/z 29 (loss of 35)

42 Espectrometria de massa Fonte de ionização: Na técnica de impacto de elétrons (EI) comumente a mais usada, as moléculas gaseificadas são bombardeadas com um feixe de elétrons (70 ev) de alta energia e aceleradas. Após a ionização, as espécies carregadas passam por um campo magnético, onde são defletidos de acordo com a razão massa/carga (m/z) para um tubo analisador e detectados. Outras fontes: Ionização química, Eletrospray, APCI e MALDI.

43 Espectrometria de massa Analisadores: Quadrupolo, tripoquadupolo, ion trap, TOF, etc...

44 Espectrometria de massa Espectrometria de massa cromatograma cocaína Espectro de massa

45 Espectrometria de massa

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