QO423 Espectrometria d e de M assas Massas

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Bernardo Taveira de Santarém
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1 QO423 Espectrometria de Massas

2 Oqueéamassadeumátomo? um M = 5 1 H (1p, 1e) = H (1p, 1n, 1e) = He (2p, 2n, 2e) = He/ 2 H = 1.98!!

3 Como é um átomo? Como o núcleo não explode?!! Modelo de Bohr

4 Forças Fundamentais E = m. c 2

5 Qual é a massa de um átomo? Massa = Soma das massas das partículas Energia liberada na formação do átomo (núcleo)

6 Defeito de massa Nenhum átomo (c/ excessão do 12 C) tem massa inteira Diferença é chamada de Defeito de Massa

7 Defeito de Massa

8 Energia de Ligação do Núcleo e Defeito de Massa 0,02 0,00 De efeito de Massa -0,02-0,04-0,06 H He Li Be B C N O F Ne Na Mg Al Si P S Cl Elemento

9 Unidade de massa atômica (u) u = x kg ( 1/12 12 C) Proton: kg ( u) Nêutron: x kg ( u) Elétron: kg (0.0005u)

10 Tipos de massas atômicas Nominal: Massa aredondada em 1 u: H = 1, C = 12, Cl = 35 Média: Massa média dos isótopos: H = , C = , Cl = 35,4532 Monoisotópica: i Massa do isótopo mais abundante: H = , C = , Cl =

11 Massas Moleculares Exatas Consiste na soma das massas atômicas É única para cada fórmula N 2 = C 2 H 4 = CO = B 2 H 6 =

12 Isótopos Naturais Substâncias Orgânicas: 1 H (99.98%), 98%) 2 H (0.01%) 01%) 12 C (98.93%), 13 C (1.07%) 14 N (99.63%), 15 N (0.37%) 16 O (99.80%), 18 O (0.20%) 32 S (94.93%), 34 S (4.29%) 35 Cl (75.78%), 37 Cl (24.22%) 79 Br (50.69%), 81 Br (49.31%)

13 MS e Padrão Isotópico MS mede isótopos individuais e não massas médias Substâncias apresentam várias massas dependendo da composição isotópica Composição isotópica varia de acordo com a composição química

massas dependendo da composição isotópica

14 Padrão Isotópico e12 % CH mass

15 e12 C 6 H 6 % mass [M+1] = 6%

16 [M 1] 22 5% [M+1] = 22.5% [M+2] = 2.3% Benzo[a]Pireno: C 20 H 12

17 e12 C 20 H 20 N 2 O 5 % mass [M+1] = 23 4% [M+1] = 23.4% [M+2] = 3.6%

18 e12 % mass CH 3 Cl

19 e CH 2 Cl 2 % mass [M+1] = 1% [M+2] = 64% [M+3] = 0% [M+4] = 10%

20 e % C 10 H 14 Cl mass [M+1] = 11% [M+2] = 64% [M+3] = 7% [M+4] = 10% [M+5] = 1%

0473 0 203 204 205 206 207 208 209 210 211

21 100 ( ) ( ); (, ) e12 % C 10 H 13 BrO mass

22 Padrão Isotópico

23 Regra do Nitrogênio Uma molécula orgânica neutra só terá massa impar se ela tiver número ímpar de nitrogênio C 2 H 4 O: 44 CH 3 CONH 2 : 59 C 6 H 4 (NH 2 ) 2 : 108 C 10H 22O: 158

24 Tabela de Isótopos Elemento Isótopo Massa (u) Abundância (%) H 1 H H C 12 C C N 14 N N O 16 O O S 32 S Cl Br 34 S Cl Cl Br Br

25 Instrumentação Introdução de amostras Fonte de Ionização Analizador de m/z Detector Vácuo Direto GC HPLC CE EI CI APCI APPI ESI MALDI FAB DESI DART B Q Tof IT LIT ICR Orbitrap Multiplicador e - MCP

26 J J. Thomson recebeu o Prêmio Nobel de Física em 1906 J. J. Thomson Descoberta do elétron e medida da sua razão massa/carga (m/z)!!

27 Ionização por Elétrons (EI)

28 EI Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção térmica), a uma pressão típica de 10-5 torr, são bombardeadas por elétrons, com energia típica de 70 ev. Ocorre principalmente a retirada ou captura de um elétron formando íons M +. ou M -.. Íons positivos são predominantes. M -. se tornam importantes para moléculas l com alta EA. M+e - (70 ev) M +. (~ 5-10 ev) + 2e - (~60-65 ev)

29 Fonte de EI

30 EI: Características Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos da fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller ). Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e se fragmentam totalt ou parcialmente. EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como também fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a 70 ev; estável; fácil de operar; alta sensibilidade. Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: moléculas orgânicas relativamente pequenas. QuandoQ d o íon molecular l não é observado (devido a dissociaçãoi excessiva), existe um processo dissociativo exotérmico e portanto M +. éumaespécieinstável. EI ocorre em ~10-16 s. Uma em cada moléculas que entram na fonte de EI é ionizada.

31 Energia das Moléculas

32 Exemplos Acetofenona m = 120

33 Exemplos Progesterone m = 314

34 Exemplos C 7 H 16 m = 100

35 Energia dos Elétrons

37 Energia x Fragmentação

38 Dissociação de Íons Radicalares M+e - M +. +2e - F +. + mol 0 F+ + Rad. F +. +mol 0 F + +Rad. F + + mol 0 F +. + mol 0 F + + Rad. F + + mol 0 F + + mol 0

39 Regra do Elétron Par Íons positivos radicalares (camada aberta) podem: Perder radical e formar fragmentos positivos (camada fechada) Perder molécula neutra e ficar positivo/radicalar (camada aberta) Íons positivos (camada fechada) podem: Perder moléculas neutras e ficar positivo (camada fechada)

40 Definições Íon Molecular: íon correspondente à molécula ionizada: M +. Pico base: íon mais intenso no espectro

41 Fragmentações em EI Localizar Íon Molecular Observar característica do espectro Analisar as fragmentações

42 Íon Molecular Íon de mais alta massa (descontado 13 C) Se tem alta exatidão, calcular DBI Verificar fragmentações lógicas

43 Exemplo

44 Exemplo

45 Exemplos Progesterone m = 314

46 Exemplos C 7 H 16 m = 100

47 Mecanismos de Fragmentação 4 clivagens principais: Dissociação sigma Clivagem alfa Clivagem indutiva Fragmentação remota Rearranjos Mclafferty

48 Fragmentação de Hidrocabonetos Dissociação Sigma seguida de perda de alcenos Íons moleculares pouco intensos Ramificação dirige i a fragmentação Íons característicos: acte cos 15, 29, 43, 57, 71

49 Exemplos

50 Exemplos

51 Exemplos

52 Alcenos Dissociação Sigma Formação de íon alílico Forma série C 2 H 2n-1 (2 u menor que Alcano)

53 Exemplos

54 Álcoois

55 Exemplos

59 Aromáticos Formam gerlamente, m/z 77, 78 e/ou 79 m/z 91 / 92 para alquil-aromáticos aromáticos Íons característicos de m/z 39, 51 e 65 Íons moleculares mais intensos que HC

60 Aromáticos

61 Aromáticos

62 Álcoois

63 Álcoois

64 Álcoois

66 EI Gera M +. e fragmentos Pode não gerar íon molécular

67 Ionização Química (CI) Munson and Field EI: Simples Produz extensa fragmentação Muitas vezes tem M +. Quando não tem M +.

69 Controle da Exotermicidade da Reação: Extensão de Fragmentação

70 CH 4 Exemplos Iso-C 4 H 10 NH 3

71 Exemplos

72 Exemplos

73 GC/MS

74 GC/MS Mass Analyzer

75 GC/MS

76 Estrutura dos dados

77 GC/MS

78 GC/MS Mass Analyzer

79 GC/MS

80 Estrutura dos dados

81 Modos de aquisição Varredura Análises qualitativas Análises quantitativas (menor sensibilidade) SIM (Selected Ion Monitoring) i Análises quantitativas (maior sensibilidade)

82 Eletrospray John Fenn 1989 Prêmio Nobel em Química 2002! Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675. Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64. "Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,

83 ESI: Princípio Geral

84 ESI: Princípio Geral Uma solução da amostra em ph ácido ou básico (ou neutra de um sal) é submetida a um spray eletrolítico sob pressão atmosférica. Um fino spray (aerosol) se forma (cone de taylor) na presença de um alto campo elétrico de +4000V (ou 4000V). O contra-íon é oxidado (ou reduzido) e formam-se gôtas com excesso de carga positiva (ou negativa). O solvente evapora, e o volume das gôtas é reduzido, e as gôtas se subdividem. Eventualmente, devido a alta repulsão entre os íons de mesma carga, ou se formam gôtas contendo apenas um íon (modelo CRM) ou íons evaporam (são ejetados ) das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de evaporação de íons).

85 Mecanismo de Dessorção

86 Sonda de ESI

87 ESI e NanoESI

88 ESI: Moléculas Orgânicas

89 ESI: Moléculas Orgânicas

90 Complexos Organometálicos N O O O Ru O O O O Ru N N O O Ru O O O % N O m/z % m/z

91 Polímeros C 9 H 19 O(CH 2 CH 2 O) n H

92 ESI Glu-Fibrinopeptídeo (1568.9) 100 ( ) % % m/z 0 m/z ( ) / 2 = ( ) / 2 = ( ) / 2 =

93 Íons Multicarregados: Padrão Isotópico +1 = 1/1 = = 1/2 = = 1/3 = = 1/4 = 0.25

94 Íons Multicarregados B-Gal 10 fm/ul hilo08 83 (2.432) 100 1: TOF MS Survey ES B-Gal 10 fm/ul hilo08 83 (2.432) : TOF MS Survey ES % % m/z m/z B-Gal 10 fm/ul hilo08 83 (2.432) : TOF MS Survey ES+ 103 B-Gal 10 fm/ul hilo08 83 (2.432) : TOF MS Survey ES % % m/z 0 m/z

95 ESI de Proteínas Mioglobina: (16881 Da) : ( ) / 20 = ( ) / 21 = TOF MS ES e3 ( ) / 22 = teste Mioglobina 891 (16.772) Cm (889:907) 100 % (M + x) / x = m/z1 (M + x +1) / (x +1) = m/z m/z e3 % m/z

96 ESI: Complexos Urease da Helicobacter pylori

97 1.05 MDa!

98 ESI de Vírus Intacto

99 LC-MS ESI: Introdução de amostra em solução Possibilidade de acoplamento c/ HPLC

100 LC-MS Urina: Metabólitos

101 Total: ~1500 peptídeos!

102 MALDI Ionização e Dessorção a LASER Auxiliada por Matriz Koichi Tanaka Michael Karas Franz Hillenkamp

103 MALDI: Princípio ION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi and ION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi and Richard Knochenmuss, Mass Spectrometry Reviews, 1998, 17,

104 MALDI: Princípio

105 Nuvem de plasma (Plume)

106 MALDI

107 MALDI: Íons Monocarregados 100 ( ) ( ) ( ) ( ) e3 % m/z

108 MALDI: Sensibilidade 42 Zeptomols (25000 Moléculas) de substância P!!! J Am Soc Mass Spectrom 2001, 12,

109 Matrizes

110 Fulerenos

111 Polímeros PEG 10KDa

112 Proteínas?

113

114 MALDI: Características Forma íons monocarregados Sensível Rápido para amostras individuais Mais Tolerante a contaminantes Problemas com massa baixa

115 MS: Métodos de Ionização ssa Mas MALDI EI ESI Polaridade

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