01/04/2015. Métodos Instrumentais Farmacêuticos FENÔMENOS DE SUPERFÍCIE. Cromatografia. Parte 2 CROMATOGRAFIA E ELETROFORESE CROMATOGRAFIA

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1 Métodos Instrumentais Farmacêuticos FENÔMENOS DE SUPERFÍCIE Cromatografia CROMATOGRAFIA Plano de Aula -Princípios da separação de moléculas -Cromatografia: Classificação e mecanismos de separação -Cromatografia em coluna: fundamentos e princípios -Cromatografia gasosa (CG) e líquida de alta eficiência (CLAE) Parte 2 Profª Juliana Schmidt Farmácia 2014 CROMATOGRAFIA Bibliografia BACCAN, Nivaldo (Et. al.) Quimica analitica quantitativa elementar. 3. ed. rev., ampl. e reestrut. Sao Paulo: E. Blucher, p. ISBN HARRIS, Daniel C. Análise química quantitativa. 6. ed. Rio de Janeiro: LTC, p. ISBN HOLLER, F. James; SKOOG, Douglas A; CROUCH, Stanley R. Princípios de análise instrumental. 6. ed. Porto Alegre: Bookman, p. ISBN (enc.). Métodos analíticos instrumentais para separação de substâncias presentes em uma mistura, baseados nas diferentes propriedades físico-químicas e nas forças de interação intermolecular presentes no sistema CROMATOGRAFIA E ELETROFORESE 1

2 Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). Exclusão Partição Adsorção Troca Iônica Afinidade ADSORÇÃO -FaseMóvelLíq. ougás - Fase Estacionária Sólida Processosde Adsorção/Dessorção Ligaçõesde hidrogênio; Forçasde Van derwaals Diferença entre Absorção e Adsorção ADSORÇÃO Fase Estacionária Sólida: Polar Aumento da Atividade -COOH > -OH > -NH 2 > -SH > -CHO > -C=O > -COOR > -OCH 3 > -CH=CH- A função das fases móveis na cromatografia por adsorçãotem sentido amplo: a) Função solvente Solubilizar os componentes Ter baixo ponto de ebulição b) Função eluente Conduzir os componentes da mistura pela coluna Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE) SOLVENTES PARA FASE MÓVEL: Polaridade em Ordem Crescente Hexano< Éterde Petróleo< Ciclohexano< Tetracloretode Carbono< Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetatode Etila< Acetona< Etanol< Metanol< ÁcidoAcético 2

3 PARTIÇÃO Fase Móvel Gasosa PARTIÇÃO Fase Estacionária Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Volatilidade A volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade. Processos de Solubilidade A volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade. TROCA IÔNICA Fase Estacionária Sólida Processo de Troca Iônica Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz Fluxo da FM TROCA IÔNICA Resinas Catiônicas e Aniônicas FE altamente carregada Maior Interação Íons de alta carga Íons de menor tamanho A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por ph e força iônica TROCA IÔNICA através de resinas iônicas são retirados os íons presentes na água Água DEIONIZADA O ajuste do ph proporciona a separação das duas proteínas 3

4 Fluxo da FM EXCLUSÃO Fase Estacionária em Gel que cobre um sólido de porosidade controlada EXCLUSÃO - Separação de tamanhos específicos - Separação de polímeros e proteínas - Determinação de Massa Molar Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídascontornando as estruturas moleculares da FE. Tipos de Géis Dextrano(Sephadex), Poliacrilamida, Ágar e Agarose AFINIDADE Fase Estacionária Sólida Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). Processo baseado em Propriedades Biológicas e Funcionais Configuração Instrumental Componentes básicos de um cromatógrafo Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analitodissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel: Ocorre um quase-equilíbrio entre o analitosorvido na FE e dissolvido na FM. K = C [ A] FE [ A] FM K C = Constante de Distribuição [A] FE = concentração do analito na FE [A] FM = concentração do analito na FM Afinidade pela FE MENOR RETENÇÃO!!! Volatilidade Afinidade pela FM [A] FE [A] FM 4

5 Eficiência da coluna Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: Cada estágio de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO EFICIÊNCIAde uma coluna é definida como sua capacidade de produzir picos estreitos e agudos. RESOLUÇÃOde uma coluna é sua capacidade de separar satisfatoriamente dois picos adjacentes. t R w b N Coluna mais eficiente Análise qualitativa O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, t R : Detecção Entendendo o cromatograma t R t R = t R - t M t R = Tempo de Retenção(tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) SINAL t M TEMPO t M = Tempo morto (tempo que a FM leva para percorrer a coluna) t R = Tempo de Retenção Ajustado (tempo que as moléculas do analito passam sorvidas na FE) Análise quantitativa O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: Análise quantitativa Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica. Área da banda cromatográfica mais recomendado amostra Área SINAL Área Altura Concentração TEMPO tempo 5

6 Análise quantitativa Detecção Quantificação concentração na amostra amostra Área Concentração Adicionada tempo Cromatografia Gasosa - CG Cromatografia gasosa Cromatografia Líquida de alta eficiência Fase estacionária LÍQUIDO OU SÓLIDO Fase móvel GÁS Detecção COLUNA de Separação Cromatografia Gasosa - CG Cromatografia Gasosa - CG Injetor: submetido à temperatura controlada Fase móvel: gás inerte Detector: submetido à temperatura controlada Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas Aplicabilidade Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS(= evaporáveis ) Quais misturas podem ser separadas por CG? para uma substância qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás. DE FORMA GERAL: Separação e análise de misturas cujos constituintes tenham pontos de ebulição de até 300 o Ce que sejam termicamente estáveis. 6

7 Cromatografia Líquida de alta eficiência - CLAE Cromatografia Líquida de alta eficiência - CLAE Aplicabilidade Fase móvel: Líquido baixa viscosidade Fase estacionária: Sólido Quais misturas podem ser separadas por CLAE? para uma substância qualquer poder ser arrastada por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molecular de 32 até Cromatografia Líquida de alta eficiência - CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE DE FORMA GERAL: Aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica. Campo Farmacêutico Bioquímico Produtos alimentícios Produtos químicos Poluentes Química forense Clínica médica Misturas típicas Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas) Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos Questões sobre Cromatografia em coluna 1) Explique os princípios básicos do método cromatográfico em coluna. 2) Explique como a cromatografia em coluna permite identificar e quantificar substâncias presentes numa mistura. 3) Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas? Explique. 4) Compare a cromatografia gasosa e a CLAE, destacando semelhanças e diferenças entre elas. 5) A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito? A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre? 6) Descreva os componentes básicos de um equipamento para cromatografia e explique, brevemente, a função de cada um deles. 7

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