Eletroforese Capilar(EC) EC - Técnica instrumental. Eletroforese capilar e Cromatografia Líquida 30/05/2012. Analítica V: 1S2012.
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- Marcelo Arantes Lancastre
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1 Analítica V: 1S2012 EC - Técnica instrumental Eletroforese capilar e Cromatografia Líquida Prof. Rafael Sousa Departamento de Química - ICE rafael.arromba@ufjf.edu.br Notas de aula: Capilar preenchido com uma solução tampão imerso em recipientes contendo o mesmo tampão (potencial) Amostra é depositada na extremidade do capilar oposta ao detector Voltagens de 5 60 kv Correntes de ma(feo) espectrofotométrico de UV-Vis Eletroforese Capilar(EC) EC: Na Prática TÉCNICA ELETROANALÍTICA HISTÓRICO Criada por Arne Tiselius para estudar proteínas em soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948) APLICAÇÕES Compostos orgânicos e inorgânicos Macromoléculas (DNA e RNA) Introduzida como técnica instrumental (1981): EC Jorgenson e Lukacs OBS: Esta animação é uma cortesia do Prof Marcone Leal (DQ-UFJF) 1
2 Principio da separação em eletroforese Diferença nas velocidades de migração de compostos diferentes quando aplicado uma ddp entre as extremidades do capilar (4 5 µl) Instrumentação ν = µ e E µ e mobilidade eletroforética E força do campo elétrico (POTENCIAL/DISTÂNCIA) Altos potenciais velocidade de migração elevada separação rápida EFICIÊNCIA DA SEPARAÇÃO: NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N) µ e V N = D coeficiente de difusão (cm 2 s -1 ) 2D N é geralmente superior àqueles conseguidos em CLAE! Eletrodos de Pt Fluxo eletroosmótico(feo) Introdução da amostra Volumes de 10 a 100 nl são introduzidos no capilar pressão capilar vácuo capilar Dependente do ph (geralmente acima de 3): ionização dos grupos silanóis Não funciona quando se enche o capilar com gel amostra de eletrólito amostra de eletrólito Velocidade de fluxo uniforme e sem pressão (em contrário à CLAE) sifonamento capilar eletrocinético capilar Atua como uma bomba amostra amostra Não favorece o alargamento de pico Favorece a injeção de uma quantidade maior dos íons de maior mobilidade 2
3 Capilares Comprimento de cm Diâmetro interno de µm Vidro Teflon (não usado com as voltagens mais elevadas) Sílica fundida A superfície interna pode ser quimicamente modificada O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido (repetibilidade) Sinal analítico - Cátions migram mais rápido Eletroferograma: resposta em função do tempo Diferença na mobilidade dos solutos -Compostos neutros (em uma única zona ) seguem o FEO (cetonas) - Ânions migram mais lentamente (vão no sentido contrário ao FEO) Responde à passagem das espécies on-column (Cada espécie apresenta um tempo de passagem diferente) VÁRIOS TIPOS de detectores PODEM SER USADOS Mais comum: Espectrofotométrico no UV-Vis caráter universal Outros exemplos: - Fluorescência induzida por laser - Amperométricos, condutométricos (precisam ser devidamente isolados, eletricamente, do capilar) Acoplamento com outras técnicas - Espectrometria de massas (informações estruturais das moléculas) Fatores que afetam o sinal Aquecimento Joule A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar CAUSA alargamento dos picos PARA EVITAR: - Usar voltagem e tampão em conc. adequadas Comprimento de injeção Comprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois a janela de detecção é da ordem de 0,1 mm CAUSA alargamento dos picos PARA EVITAR: -Usar um solvente com força iônica menor que a do tampão (para que a corrente atua mais sobre os analitos, que chegarão mais rápido na outra extremidade da coluna) 3
4 Análise quali e quantitativa Modos de separação por eletroforese Necessidade de calibração - Eletroforese capilar em solução livre (ECSL) Compara-se a resposta de PADRÕES e AMOSTRAS nas mesmas condições Respostas (nos tempos de migração correspondentes): - Áreas dos picos (de espectros UV-Vis, p. ex) - Construção de curvas de calibração - Eletroforese capilar em gel (ECG) - Isotacoforese capilar (IC) - Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM) - Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI) Análise quali e quantitativa Exemplo de resultado Modos de separação por eletroforese Eletroforese capilar em solução livre (ECSL) Baseada nas diferenças das velocidades de migração de espécies iônicas em um dado tampão Não serve para espécies neutras (a menos que sejam derivatizadas) Eletroforese capilar em gel (ECG) Molécula de DNA O capilar é preenchido por um gel com tamanho de poro apropriado Macromoléculas como DNA podem ser separadas em função do tamanho (menores ficam menos retidas, ao contrário da CE) Também não ocorre separação das espécies neutras 4
5 Modos de separação por eletroforese Eletroforese capilar em gel (ECG) Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI) Substâncias anfóteras (proteínas) ficam focalizadas em uma dada região do capilar devido a um gradiente de ph Utiliza-se uma mistura de anfólitos* para dissolver a amostra O cátodo é mantido em ph alto e o ânodo em ph baixo * ács. poliméricos sintéticos Isotacoforese capilar (IC) Em um dos tampões: íons com alta mobilidade (dianteiros) - localizado próximo ao detector No outro: íons com baixa mobilidade (terminadores) Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI) - componentes da amostra se separam em zonas (de acordo com a sua mobilidade) - todas essas zonas se movem com a mesma velocidade - Na quantificação se mede os comprimentos das zonas A, B e C ficam focalizadas na região de ph que corresponde ao seu ponto isoelétrico 5
6 Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM) técnica híbrida Utiliza-se eletrólitos contendo conc. elevadas de surfactantes a ponto de formarem micelas (carga neg.) Espécies positivas movem-se mais lentamente Espécies neutras sofrem partição entre as micelas e a fase aquosa do tampão (migração intermediária) Espécies negativas são repelidas pelas micelas e migram mais rapidamente Referências Skoog,D.A.,Holler,F.J.;Nieman, T.A. Principles of Instrumental Analysis 5 th ed.,saunders CollegePublishing, 1998 Harris, D. C. Análise Química Quantitativa 7 a ed.,ltc LivrosTécnicoseCientíficos Editora, 2008 Grossman, P. D.; Colburn. J. C. Capillary Electrophoresis. Theory and Practice Academic Press Inc., 1992 VANTAGEM SOBRE CLL: Maior eficiência de separação Queiroz, SCN; Jardim, ICSF; Eletroforese Capilar, Chemkeys, 2001 Tavares, M; Eletroforese Capilar: Conceitos Básicos, Quim. Nova, 19 (1996) 173 Vantagens e desvantagens VANTAGENS: Elevada frequencia analítica (rapidez) Versatilidade Baixo custo - Baixo consumo de amostras, reagentes e solventes Desempenho analítico satisfatório - Excelentes separações e resoluções Possibilidade detecção on line Questões 1- Defina eletroforese capilar e explique o que é o fluxo eletroosmótico. - Técnica separação na qual a separação de substâncias iônicas ocorre em função da carga e da mobilidade iônica. - O fluco eletroosmótico (FEO) é o fluxo de espécies carregadas (íons) do tampão que migram do anodo (+) para o catodo (-), carreando os constituintes da amostra. DESVANTAGENS: Não se aplica a todos os tipos de compostos, como: - Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar (adequados para CG) - Polímeros iônicos de massa molar alta 6
7 2- Em relação ao sinal analítico, qual é o perfil esperado para um eletroferograma? Justifique. As espécies com carga positiva saem primeiro (migram mais rápido), as espécies com carga negativa saem por último (sofrem repulsão pela catodo) e as espécies neutras saem entre as positivas e as negativas, por serem carreadas pelo FEO. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (CL) em Inglês Interação diferenciada dos componentes da amostra com uma FASE ESTACIONÁRIA e uma FASE MÓVEL sólido ou líquido líquido ou gás Crom. líquida (CL) Crom. gasosa (CG) 3- Cite duas fontes de alargamento de banda na eletroforese capilar e comente como este problema pode ser minimizado. Uma das diferenças entre a CG e a CL são as configurações experimentais: - Quantidades de amostra elevadas (comprimentos de injeção grandes); - Aquecimento joule (corrente formada no capilar); Quantidades adequadas de amostras, tampões apropriados e usar sistema de refrigeração do capilar. FASE ESTACIONÁRIA Sólido líquido sobre um sólido CONFIGURAÇÃO EXPERIMENTAL PLANAR COLUNA 7
8 Ex de interação analito - FE Cromatografia em coluna Convencional (Clássica) Líquida de alta eficiência (CLAE) Solvente Fase estacionária Suporte inerte Equilíbrio FE (partição na crom. Líquido-líquido) Diferente para as substâncias diferentes Polaridade Tamanho - s verticais ( - gravidade) - Análises quali e quantitativas - Baixo custo - Baixa frequência - Desempenho regular - s e altas pressões - Análises quali e quantitativas - Desempenho analítico satisfatório - Rapidez analítica, automação - Custo elevado... Cromatografia planar Suporte da FE: papel especial OU sólido finamente dividido (capilaridade) separação Fácil realização Análises quali e quantitativas Baixo custo Baixas - Resolução e - Repetibilidade - Reprodutibilidade Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) - Amplamente utilizada - Dentre as modalidade mais importantes - Vem se desenvolvendo desde a década de 70 NÃO É UMA TÉCNICA DE ANÁLISE ABSOLUTA Necessidade de calibração RESULTADO : Amostras x Padrões (cromatograma) 8
9 Subdivisões da CLAE Tipo de FE (MECANISMO de separação) Cromatografia por afinidade: CA FE possui substâncias como enzimas e antígenos: interação seletiva com proteínas e anticorpos Cromatografia líquido-sólido: CLS FE é um sólido (adsorção) Cromatografia líquido-líquido: CLL FE é um líquido que recobre um sólido (partição) Cromatografia líquida de fase ligada: CLFL FE é um líquido ligado quimicamente a um suporte sólido (partição) Cromatografia quiral: CQ FE possui compostos com carbonos assimétricos (C*) para interagir seletivamente com compostos quirais Para aprofundar o conhecimento : Pesquisar substâncias que são determinadas por CA e por CQ Cromatografia por exclusão: CE Separação e Sinal analítico FE é um gel que recobre um sólido com porosidade controlada Aplicação importante: análise de polímeros (GPC) Cromatografia de troca iônica: CTI + componente separado FE sólida contém grupos NR 3+ (para troca aniônica) ou grupos SO 3- (para troca catiônica) Determinação de compostos de caráter iônico (aminoácidos, ânions inorgânicos, íons metálicos, etc) Mesmo princípio da Prática 10! Sinal Tempo de retenção Cromatograma 9
10 Entendendo o cromatograma Diferentes espécies SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: tr (tr= tempo de retenção medida em função do tempo) Configuração instrumental Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência: Processador-Registrador Resposta do detector sacarina aspartame benzaldeído Informações quali e quantitativas Sistema de bombeamento Pouca interação Tempo de retenção Muita interação Cada componente: função no processo analítico Análise quantitativa Sistema de bombeamento Registrador Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picos cromatográficos com áreas diferentes Necessidade de calibração: frasco de plástico ou vidro Água + Solvente(s) orgânico(s) n-hexano Acetonitrila Metanol Metil-t-butil-éter Clorofórmio Diclorometano Tetrahidrofurano 2-propanol CUIDADOS eliminação de partículas maiores que 5 µm Relaciona-se as áreas dos picos com as concentrações Análise de PADRÕES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIÇÕES retirada de gases Dissolvidos Ultrasom ou Borbulhamento gases inertes USO (preparação diária) 10
11 Sistema de bombeamento Registrador Sistema de bombeamento Registrador Impulsionar a para dentro da coluna com vazão constante e reprodutível BOMBAS DE ALTA PRESSÃO Dispositivo de aço inoxidável com uma alça de que permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna Composição constante (eluição ISOCRÁTICA) Composição variável (eluição por GRADIENTE) Bomba de seringa Bomba pneumática Amostras complexas Compostos de polaridade muito diferente Bomba recíproca Proporção do Solvente mais polar ALÇA TROCÁVEL Volumes de 2 a 1000 µl Sistema de bombeamento Registrador Sistema de bombeamento Registrador Ex: Bomba recíproca (uma das mais usadas) tubo de aço inoxidável separação Para coluna Capacidade: dimensões Фi= 1 20 mm L= 3 25 cm FE Partículas com Ф na faixa de µm Uso de partículas pequenas melhor separação (aumenta N) Desvantagens: Vazão pulsada amortecedor Cavitação (bolhas) devido à compressão Vantagem: Mudança da fase móvel + DUAS COMBINAÇÕES Fase reversa Fase normal FE apolar (baixa polaridade) polar FE polar apolar (baixa polaridade) 11
12 EFICIÊNCIA DA COLUNA RESOLUÇÃO Determinada pelo n o de etapas de equilíbrio entre o soluto na FE e o soluto na Considerações práticas Várias configurações instrumentais podem ser empregadas REPRESENTAÇÃO: N Número de pratos teóricos N = 16 tr W 2 Sinal do detector determinação de vários tipos de substâncias (mesmo em amostras complexas) sistema à alta pressão: checar vazamentos As condições instrumentais e de preparo de amostra influenciam no resultado Tempo de retenção Quanto maior o número de etapas, mais eficiente é a separação Não implica em rapidez! (Altura do prato (H): H= L / N) para minimizar os erros experimentais pode-se utilizar padrões internos (substância com características físico-químicas semelhantes às do analito e que é adicionada em quantidade fixa e conhecida) Sistema de bombeamento Registrador Questões Detecção dos componentes conforme saem da coluna UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA Diferentes tipos de detectores podem ser usados (não existem detectores universais para CLAE) - Que respondem à concentração sinal proporcional à concentração Ex: Absorção no UV-Vis, infravermelho e de fluorescência MAIS GERAIS PORÉM MENOS SENSÍVEIS 1- Descreva os componentes básicos de um equipamento para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e explique, brevemente, a função de cada um deles. 2- Os cromatogramas X, Y e Z referem-se a uma mistura de compostos presentes em analgésicos e foram obtidos em uma mesma coluna, mas utilizando fases móveis diferentes e em modo isocrático (X: 70% MeOH/ 30% HAc; Y: 60% MeOH/ 40% HAc; Z: 40% MeOH/ 60% HAc). Considerando essas informações, responda qual é o composto mais polar e qual das fases móveis você utilizaria para fazer essa mesma separação. - Que respondem à massa sinal proporcional a um fluxo de massa por unidade de tempo Ex: es eletroquímicos e de condutividade elétrica MAIS SENSÍVEIS MAS NÃO PERMITEM ELUIÇÃO COM GRADIENTE X Y Z 12
13 Referências Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis 5 th ed., Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998 Harris, D. C. Análise Química Quantitativa 7 a ed., LTC Livros Técnicos e Científicos Editora, 2008 Collins, C. H., Braga, G. L., Bonato, P. S. Fundamentos de Cromatografia 1 a ed., Editora UNICAMP: Campinas,
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