QUI 154 Química Analítica V Análise Instrumental. Aula 6 Eletroforese Capilar (EC)

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1 Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Instituto de Ciências Exatas Depto. de Química QUI 154 Química Analítica V Análise Instrumental Aula 6 Eletroforese Capilar (EC) Julio C. J. Silva Juiz de Fora, 2016

2 Introdução O fenômeno denominado eletroforese é definido como sendo a migração de espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada. Esta técnica de separação foi desenvolvida pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em 1948; Este método, denominado solução livre, era bastante limitado devido à instabilidade do aparelho, e mais significativamente, pelos efeitos de difusão e aquecimento gerados pelo campo elétrico, os quais comprometiam a resolução (a separação) dos compostos. Estes efeitos foram minimizados com a introdução de suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre dos analitos, de forma que o efeito da difusão fosse diminuído.

3 Introdução Entretanto este sistema oferecia um baixo nível de automação, tempos de análise longos e após a separação a detecção era feita visualmente A eletroforese capilar (EC) é uma técnica que foi introduzida em 1981, por Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita cada vez mais, como um importante método analítico. Em sua forma mais simples a EC é uma aproximação da técnica original, descrita por Tiselius, porém emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrólito, conforme o próprio nome sugere.

4 Introdução EC separações de ânions e cátions inorgânicos, EC aminoácidos, catecolaminas, drogas, vitaminas, carboidratos, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, polinucleotídeos, entre outras. EC Separação de proteínas (enzimas, hormônios, anticorpos) e ácidos nucléicos (DNA, RNA)

5 Instrumentação Capilar sílica fundida preenchido (d.i. entre µm), comprimento de cm, Capilar preenchido com tampão e estendido entre dois reservatórios de tampão que também contêm eletrodos de platina. Introdução/detecção da amostras em uma das extremidades e a detecção na outra.

6 Instrumentação A introdução da amostra injeção sob pressão (o frasco é elevado por curto intervalo de tempo acima do nível do capilar para forçar a amostra para dentro do tubo) A introdução da amostra aplicação de vácuo no tubo, na extremidade do detector. A introdução da amostra fluxo eletroosmótico (FEO) Volumes típicos nl Separação um potencial de 5-30 kv (cc) é aplicado entre os eletrodos.

7 Instrumentação

8 Instrumentação

9 Introdução

10 Fluxo Eletroosmótico A parede do capilar de sílica contém grupos silanóis (SiOH) os quais se ionizam (SiO- + H+) quando em contato com soluções tampão com ph altos. Esta dissociação produz uma superfície carregada negativamente. Uma camada de contra-íon (cátions) é então formada próxima à parede do capilar a fim de manter a eletroneutralidade. Isto forma a dupla camada e cria uma diferença de potencial muito próxima à parede e este fenômeno é conhecido como potencial zeta.

11 Fluxo Eletroosmótico

12 Fluxo Eletroosmótico

13 Fluxo Eletroosmótico v = velocidade de migração µe = mobilidade eletroforética V = Voltagem aplicada L = Comprimento do tubo entre os dois eletrodos

14 Fluxo Eletroosmótico V total = V eo + V e

15 Separações Eletroforéticas

16 Separações Eletroforéticas N= Números de pratos D = Coeficiente de difusão (cm 2 s -1 ) µ e = Mobilidade eletroforética

17 Modos de Separação Eletroforese nome genérico Eletroforese Capilar em Solução Livre (ECSL) Eletroforese Capilar por Zona (ECZ) A separação de íons é a forma mais simples de EC e é denominada eletroforese capilar em solução livre. Muitos compostos podem ser separados rapidamente e facilmente por esta técnica. A separação em ECSL é baseada nas diferenças nas mobilidades eletroforéticas resultantes das diferentes velocidades de migrações de espécies iônicas no tampão, contido dentro do capilar. O mecanismo de separação é baseado nas diferenças de razão massa/carga dos solutos em um dado ph. Na ECSL espécies neutras não são separadas, porém permite a separação de cátions e ânions na mesma corrida

18 Modos de Separação Eletroforese Capilar em Gel (ECG) A separação de biomoléculas grandes, tais como DNA, por ECSL, às vezes é muito difícil de se obter devido à similaridade nas razões massa/carga. Assim ECSL muitas vezes não é suficiente para separar estes tipos de substâncias. Uma alternativa é preencher o capilar com um gel, onde o principal mecanismo de separação está baseado nas diferenças nos tamanhos dos solutos que migram através dos poros do polímero. Esta técnica é denominada eletroforese capilar em gel.

19 Modos de Separação

20 Análise de DNA, RNA e Proteínas Composição de aminoácidos: Um aminoácido é composto por um grupo amino (NH 2 ) e um grupo carboxil (COOH), ligados a um átomo de carbono. Um grupo R, também ligado a este átomo de carbono,(dependendo da composição do grupo R), formam diferentes tipos de aminoácidos

21 Análise de DNA, RNA e Proteínas Fatores que afetam a migração de fragmento de DNA em géis Tamanho do DNA Concentração Conformação do DNA

22 Análise de DNA, RNA e Proteínas Meio alcalino (ph > 7): negativamente carregados por se comportarem como um ácido. Meio ácido (ph < 7) - positivamente carregados por se comportarem como uma base. Solução neutra: Estado de equilíbrio formando íon dipolar (negativas e positivas ao mesmo tempo)

23 Análise de DNA, RNA e Proteínas

24 Análise de DNA, RNA e Proteínas Hemoglobina Proteínas DNA

25 Modos de Separação Eletrocromatografia Capilar Micelar (ECCM) A ECCM foi inicialmente desenvolvida para a resolução de compostos neutros, os quais não podem ser separados usando simplesmente a ECSL. As condições de separação envolvem o uso de eletrólitos contendo níveis relativamente altos de surfactantes, tal como dodecilssulfato de sódio (SDS). Acima de uma determinada concentração, denominada de concentração micelar crítica (CMC), as moléculas de surfactante começam a agregar-se, formando micelas. A separação é baseada na partição das moléculas entre a fase micelar (pseudo-fase estacionária) e o tampão aquoso. As micelas de SDS têm carga negativa e migram contra o FEO.

26 Modos de Separação (ECCM)

27 Outros Modos de Separação Eletroforese Capilar com Focalização Isoelétrica (ECFI) Isotacoforese Capilar (IC)

28 Aplicações (Separações de íons pequenos Separação de íons pequenos

29 Aplicações (separações de íons pequenos)

30 Aplicações (separações de espécies moleculares)

31 Aplicações (separações de espécies moleculares)

32 Aplicações (separações de espécies moleculares)

33 Vantagens e Limitações Vantagens: Rapidez; Versatilidade; Baixo custo por análise; Alto poder se separação (resolução); Consumo mínimo de amostras, reagentes e solventes. Possibilidade de automação e detecção on-line. Limitações: Não é adequada para: Compostos voláteis; Não-polares e de massa molar baixa (GC melhor opção) polímeros não iônicos de massa molar alta Não é tão sensível quanto a cromatografia líquida de alta eficiência.

34 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Silva, L.L.R. Notas de Aula. FACET, UFVJM, Cadore, S. Notas de Aula. IQ, UNICAMP, SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios de Análise Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman, COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos de Cromatografia, Editora Unicamp, Queiroz, S.C.N., Jardim, I.C.S.F. Eletroforese Capilar, chemkeys.co 6. Vivas, W. L. P., Notas de Aula. Proead. UNIT Fernandes, A. Notas de Aula. Fundamentos de Extração de DNA. UFSC. 2010