MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

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1 PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS: MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Aula 8 Cromatografia Liquida de Alta Eficiência CLAE (Continuação) Profa. Daniele Adão - Solvente grau HPLC (alta pureza): impurezas presentes na FM podem diminuir a sensibilidade do detector. - Dissolver a amostra sem decompor seus componentes: o solvente da amostra normalmente é a própria FM ou um de seus componentes. - Ter polaridade e viscosidade adequadas. - Não degradas a FE. -Ser compatível com detector utilizado. VISCOSIDADE: - Os mais indicados como FM são os solventes com baixa viscosidade menor perda de carga no bombeamento. - A viscosidade é uma propriedade que afeta a queda de pressão dentro da coluna quanto > viscosidade, > coeficiente de difusão do soluto, < número de pratos, < eficiência. PRESSÃO DE VAPOR: - Relacionada a perda por evaporação: contaminação do ambiente de trabalho e acidentes devido a ignição. -Solventes muito voláteis, ou pouco voláteis operados a altas temperaturas, podem causar fenômenos de cavitação no bombeamento perda de reprodutibilidade da vazão e por consequência do t R. PADRÃO DE ÁGUA PARA USO COMO FM: - Água mono-destilada e deionizada comum são inadequadas: contaminação de orgânicos voláteis e de orgânicos da resina. - Água grau HPLC: purificada com resinas de troca iônica, carvão ativado, filtros de membrana (livre de bactérias). Não pode ser estocada pois é facilmente contaminada. DEGASEIFICAÇÃO DA FM: Indispensável para o bom funcionamento do sistema. Garantia de maior: - Reprodutibilidade da vazão: retira ar dissolvido na FM e evita bolhas na bomba; - Estabilidade na linha de base: bolhas no detector causam instabilidade na linha base do cromatograma. 1

2 MÉTODOS DE DEGASEIFICAÇÃO: Ultrassom: Pouco eficiente quando utilizado sozinho; Vácuo + ultrassom: Rápido e eficiente; Purga com He: Maior custo operacional e pode aumentar vazamentos; Degaseificador on-line : Remove o ar antes de entrar na bomba, investimento inicial elevado porém a melhor opção. RELAÇÃO ENTRE SELETIVIDADE COM POLARIDADE DA FM: Ao variar a polaridade da fase móvel, varia o fator de retenção (k = t R /t o ) e consequentemente a seletividade na separação. Variação de t R e resolução com a composição do solvente em análise de metil, etil, propil e butil parabenos. coluna ODS (10cm x 0.6 cm), UV 254nm, 40 C, água/metanol 2

3 Bombeamento isocrático e por gradiente Bombeamento isocrático e por gradiente ISOCRÁTICA: Mesma composição da FM durante a eluição. Exemplo: Hexano ou Metanol:Água (80:20 v/v) GRADIENTE: Composição da FM varia durante a eluição. Essa técnica é utilizada na separação de misturas complexas com diferentes funções químicas. Exemplo: Tempo Fluxo %A %B Inicial 1, , , , , Bombeamento isocrático e por gradiente Bombeamento isocrático e por gradiente Exemplo de cromatogramas obtidos com separação isocrática (inferior) e gradiente (superior) Bombeamento isocrático e por gradiente Não são todos os métodos CL que podem utilizar o sistema de bombeamento por gradiente: Troca iônica - Sim Mudança no modificador orgânico: a b c d [ MeOH/H 2 O ] par crítico : c,d Líquido/Líquido Difícil Fase ligada Sim a b c d [ THF/H 2 O ] par crítico : a,b Exclusão Não (O método de separação está diretamente relacionado a FE). a b c d [ MeOH/THF/H 2 O ] Adsorção - Sim 3

4 Seleção da FM em função das propriedades físicas: relação entre seletividade com polaridade da FM Variação do fator de retenção com a composição da FM Seleção da FM no desenvolvimento do método analítico: Separação isocrática com fase reversa Escolher a coluna conveniente (C8 C18); Fixar a temperatura da coluna (40 C); Para compostos ácidos ou básicos ajustar a FM água com H 3 PO 4 a 0,05M - ajustar o ph a 3.5 com NaOH; Equilibrar a coluna com solvente orgânico puro (acetonitrila ou metanol, vazão = 1,5ml/min); Injetar l da amostra; Se os componentes eluírem perto de t o, repetir as análises alterando a concentração de água crescentemente até o obter separação satisfatória. Relação entre polaridade de colunas, solventes e amostras. Influência do ph A seleção do ph ideal é um dos parâmetros mais importantes. Influência do ph Detectores - Classificação Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito. Angiotensin II Angiotensin III UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. O ajuste do ph com solução tampão é necessário para separação reprodutível de compostos ionizáveis por CLAE de fase reversa. O ph da FM na cromatografia com fase reversa usualmente está entre 2,0 e 7,5. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. 4

5 Detectores O detector ideal é aquele que apresenta as seguintes características: ter alta sensibilidade: detectar pequenas quantidades de amostra; ser estável: insensível a variações de temperatura e de fluxo, no caso de eluições com gradiente; linearidade: o sinal deve manter uma relação linear com a concentração da amostra; uma leitura contínua; resposta universal: capaz de trabalhar com todos os tipos de amostra Detectores por Absorvância no UV-VIS Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. CARACTERÍSTICAS: - Seletivo (moléculas com cromóforos); - Comprimento de onda (λ) fixo (Fotométrico); - λ pode ser selecionado ( nm) (Espectrofotométrico); OBSERVAÇÃO: Os solventes também absorvem Solvente Água MeOH ACN Acetona Hexano Clorofórmio THF λ nm Detectores por Absorvância no UV-VIS Detectores por Absorvância no UV-VIS Comumente usado na CLAE porque muitos solutos absorvem a radiação ultravioleta: SUBSTÂNCIAS QUE ABSORVEM NA REGIÃO UV: Todas as substâncias que têm elétrons p e elétrons desemparelhados; Uma dupla ligação adjacente a um átomo contendo elétrons desemparelhados; Compostos contendo Br, I, S, -CO, -NO 2 ; Íons inorgânicos (Br -, I -, NO 3-, NO 2- ; Duas duplas ligações conjugadas. UV-Vis detection of sugars in juice Detectores por Absorvância no UV-VIS Uma amostra contêm os três compostos a seguir. Quais desses compostos não poderá ser identificado por CLAE com detecção por ultravioleta? UV-Vis detection of sugars in juice 5

6 R: A substância (I), pois não têm elétrons p ou elétrons desemparelhados. Logo, o composto (I) não absorve radiação UV. Detectores por Fluorescência Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV. CARACTERÍSTICAS: - Seletivo (moléculas que fluorescem p. ex.: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas); - Mais sensível que UV devido a detecção por emissão; - Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente; Detectores por Fluorescência Detectores por Fluorescência Em algumas moléculas, a absorção de um fóton é seguida por emissão de luz de um comprimento de onda maior (menor energia). Esta emissão é chamada de fluorescência. APLICAÇÃO: Compostos que fluorescem: p. ex.: HPAs e Aminoácidos. Detectores por Fluorescência Uma amostra contêm os compostos a seguir. Quais desses compostos não poderá ser identificado por CLAE com detecção por fluorescência? 6

7 R: Todos os compostos têm elétrons p, permite a absorção de radição UV que permite a excitação do elétron a um nível de energia mais elevado. Quando retornam ao nível de energia mais baixo os compostos emitem radição fluorescente. Uma amostra contêm os compostos a seguir. Quais desses compostos não poderá ser identificado por CLAE com detecção por fluorescência? R: A glutationa absorção de radição UV mas não emite radiação quando passa do estado excitado para um nível de energia menor. A derivatização da glutationa com agentes seletivos para tióis (o-ftaldialdeído - fluorescente) permite identificar o composto por fluorescência ( aduto glutationa-isoindol). Detectores por Índice de Refração Princípio: Mede a diferença no índice de refração da FM e do eluante vindo da coluna. CARACTERÍSTICAS: - Não-seletivo (Permite o uso de substâncias não-cromóforas); - Sensível a variações de: - Temperatura - Pressão - Fluxo - Composição fase móvel - Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar; - Muito usado em cromatografia preparativa. APLICAÇÃO: Análises de carbohidratos e açúcares em geral. Detectores por Índice de Refração Detectores por Índice de Refração 7

8 Detectores IR x UV Detectores por Espectroscopia de massa Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z). CARACTERÍSTICAS: - Análise destrutiva; - Pode ser extremamente seletivo; - Análise de micro e macromoléculas; - Alta sensibilidade. Detectores por Espectroscopia de massa Detectores por Espectroscopia de massa Detectores Detector Limite de Gradiente Aplicação detecção (ng) Ultravioleta 0,1-1 Sim Seletivo Índice de refração Não Universal Espalhamento de luz 0,1-1 Sim Alta massa molar Eletroquímico 0,01-1 Não Seletivo Fluorescência 0,0001-0,01 Sim Seletivo Espectrometria massas 0,1-1 Sim Universal Infravermelho 1000 Sim Seletivo 8

9 Definição do problema analítico Escolha do método de análise + Amostragem Tratamento da amostra (e separação da espécie de interesse) Medida analítica (CLAE, CG, outros) A preparação de amostras tem como objetivo a remoção dos componentes interferentes das amostras e o enriquecimento seletivo das substâncias a analisar. PRINCIPAIS PARA CLAE: Filtração; Extração em fase sólida; Extração líquido-líquido. Avaliação dos resultados Filtração FILTROS DE SERINGA: os filtros de seringas são utilizados rotineiramente para remover contaminantes particulados de amostras antes de análises cromatográficas. Filtração A eficiência destes dispositivos é determinada principalmente pelo fato de remover estes contaminantes, porém sem liberar artefatos indesejáveis (p.ex., extraíveis) no filtrado. Diferentes membranas apresentam compatibilidade química diferente. Em geral, um tipo de filtro não será adequado para todas as aplicações. Filtração MATERIAIS: CA Acetato de Celulose GF Fibra de Vidro MCE Mistura Esteres de Celulose NY Nylon 66 (Poliamida 66) PES Polietersulfonado PP Polipropileno PTFE Politetrafluoroetileno PVDF Polifluoreto de vinilideno Extração em fase sólida A extração em fase sólida (SPE) permite a extração seletiva de analitos a partir de amostras complexas, bem como de amostras de grande volume, previamente às análises de CLAE. 9

10 Extração em fase sólida Extração em fase sólida - Exemplos Extração Líquido-Líquido Extração Líquido-Líquido Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante. Dados os cromatogramas individuais dos compostos a seguir, podemos afirmar que qual desses compostos NÃO está presente na amostra? AMOSTRA A B C D PADRÃO Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito 10

11 R: O composto C não está presente na amostra. Quando observando os tempos de retenção dos padrões temos: A (t R = 3,88), B (t R = 4,40), C (t R = 4,88) e D (t R = 6,13). Comparando o t R dos padrões com a amostra, temos valores muito próximos dos t R dos padrões A (t R = 3,86), B (t R = 4,48) e D (t R = 6,10). 1 PASSO: A B C D 2 PASSO: A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector. Os cromatogramas A e B apresentados anteriormente indicam que: a área do pico correspondente do composto acrilamida são diferentes para os dois cromatogramas; como foi injetado o mesmo volume do material, a concentração do composto acrilamida é diferente para a amostra A e B; A área do pico da acrilamida na amostra A é 10 vezes maior que na amostra B. Se ambos os compostos respondessem igualmente ao detector poderíamos usar a relação: Massa A Área A Massa B Área B CALIBRAÇÃO EXTERNA (CURVA ANALÍTICA): Este método baseia-se na Comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão. Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão: No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector. 11

12 s CALIBRAÇÃO INTERNA: Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração. A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. 1) Em uma análise utilizando um cromatógrafo a líquido utilizou-se uma coluna de Octadecil para eluição. Sabendo que a amostra é constituída dos compostos A + B + C e que a ordem de polaridade dos compostos é B < A < C e a ordem dos respectivos pontos de ebulição é: A>C>B, qual deverá ser a ordem de eluição? R: A coluna C18 é apolar, logo os compostos mais polares eluirão primeiro. A ordem de eluição seria: C, A e B. Como se trata de CLAE o PE não influencia no t R dos compostos. 2) Qual a diferença entre eluição isocrática e por gradiente? R: A eluição isocrática utiliza o mesmo solvente em todo o desenvolvimento cromatográfico. A eluição por gradiente, no entanto, tem uma variação da composição do eluente. s 3) Porque é necessário utilizar uma solução tampão na cromatografia em camada reversa? R: Porque o tempo de retenção e a seletividade na cromatografia em fase reversa depende do ph. A solução tampão serve para controlar o ph. s 4) Um experimento de cromatografia produziu a figura abaixo. Sabendo que o eluente era água, e que a amostra continha os 3 compostos ilustrados, relacione o número de cada mancha com a estrutura dos compostos. A C B s R: A B C B A C 12

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