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1 Analítica V: Aula 11 Eletroforese capilar Prof. Rafael Sousa Departamento de Química - ICE Notas de aula:

2 EletroforeseCapilar(EC) TÉCNICA ELETROANALÍTICA HISTÓRICO Criada por Arne Tiselius para estudar proteínas em soro na década de 30 (prêmio Nobel em 1948) APLICAÇÕES Compostos orgânicos e inorgânicos Macromoléculas (DNA e RNA) Introduzida como técnica instrumental (1981): EC Jorgenson e Lukacs

3 EC -Técnica instrumental Capilar preenchido com uma solução tampão imerso em recipientes contendo o mesmo tampão (potencial) Amostra é depositada na extremidade do capilar oposta ao detector Voltagens de 5 60 kv Correntes de ma(feo) Detector espectrofotométrico de UV-Vis

4 Principio da separação em eletroforese Diferença nas velocidades de migração de compostos diferentes quando aplicado uma ddp entre as extremidades do capilar ν = µ e E µ e mobilidade eletroforética E força do campo elétrico (POTENCIAL/DISTÂNCIA) Altos potenciais velocidade de migração elevada separação rápida EFICIÊNCIA DA SEPARAÇÃO: NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N) µ e V N = D coeficiente de difusão (cm 2 s -1 ) 2D N é geralmente superior àqueles conseguidos em CLAE!

5 Fluxo eletroosmótico(feo) Dependente do ph (geralmente acima de 3): ionização dos grupos silanóis Velocidade de fluxo uniforme e sem pressão (em contrário à CLAE) Atua como uma bomba Não favorece o alargamento de pico

6 Instrumentação (4 5 µl) µl) Eletrodos de Pt

7 Introdução da amostra Volumes de 10 a 100 nl são introduzidos no capilar Não funciona quando se enche o capilar com gel pressão amostra capilar Reservatório de eletrólito Detector vácuo amostra capilar Reservatório de eletrólito Detector sifonamento capilar eletrocinético capilar Detector Detector amostra amostra Favorece a injeção de uma quantidade maior dos íons de maior mobilidade

8 Capilares Comprimento de cm Diâmetro interno de µm Vidro Teflon Teflon(não usado com as voltagens mais elevadas) Sílica fundida A superfície interna pode ser quimicamente modificada O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido (repetibilidade)

9 Detector Responde à passagem das espécies on-column (Cada espécie apresenta um tempo de passagem diferente) VÁRIOS TIPOS de detectores PODEM SER USADOS Mais comum: Espectrofotométrico no UV-Vis Vis caráter universal Outros exemplos: - Fluorescência induzida por laser - Amperométricos, condutométricos (precisam ser devidamente isolados, eletricamente, do capilar) Acoplamento com outras técnicas Acoplamento com outras técnicas - Espectrometria de massas (informações estruturais)

10 Sinal analítico Eletroferograma: resposta em função do tempo Diferença na mobilidade dos solutos -Cátions migram mais rápido -Compostos neutros (em uma única zona ) seguem o FEO (cetonas) -Ânions migram mais lentamente (vão no sentido contrário ao FEO)

11 Fatores que afetam o sinal Aquecimento Joule A passagem da corrente promove um aquecimento do capilar CAUSA alargamento dos picos PARA EVITAR: - Usar voltagem e tampão em conc. adequadas Comprimento de injeção Comprimentos na ordem de mm podem ser grandes, pois a janela de detecção é da ordem de 0,1 mm CAUSA alargamento dos picos PARA EVITAR: PARA EVITAR: -Usar um solvente com força iônica menor que a do tampão

12 Análise qualie quantitativa Necessidade de calibração Compara-se a resposta de PADRÕES e AMOSTRAS nas mesmas condições Respostas (nos tempos de migração correspondentes): - Áreas dos picos (de espectros UV-Vis, p. ex) - Construção de curvas de calibração

13 Análise quali e quantitativa Exemplo de resultado

14 Modos de separação por eletroforese - Eletroforese capilar em solução livre (ECSL) - Eletroforese capilar em gel (ECG) - Isotacoforese capilar (IC) - Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM) - Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI)

15 Modos de separação por eletroforese Eletroforese capilar em solução livre (ECSL) Baseada nas diferenças das velocidades de migração de espécies iônicas em um dado tampão Não serve para espécies neutras (a menos que sejam derivatizadas) Eletroforese capilar em gel (ECG) Molécula de DNA O capilar é preenchido por um gel com tamanho de poro apropriado Macromoléculas como DNA podem ser separadas em função do tamanho (menores ficam menos retidas, ao contrário da CE) Como o FEO é suprimido não ocorre separação das espécies neutras

16 Modos de separação por eletroforese Eletroforese capilar em gel (ECG)

17 Isotacoforese capilar (IC) Em um dos tampões: íons com alta mobilidade (dianteiros) - localizado próximo ao detector No outro: íons com baixa mobilidade (terminadores) - componentes da amostra se separam em zonas (de acordo com a sua mobilidade) - todas essas zonas se movem com a mesma velocidade - Na quantificação se mede os comprimentos das zonas

18 Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI) Substâncias anfóteras (proteínas) ficam focalizadas em uma dada região do capilar devido a um gradiente de ph Utiliza-se uma mistura de anfólitos* para dissolver a amostra O cátodo é mantido em ph alto e o ânodo em ph baixo * ács. poliméricos sintéticos

19 Eletroforese capilar com focalização isoelétrica (ECFI) A, B e C ficam focalizadas na região de ph que corresponde ao seu ponto isoelétrico

20 Eletrocromatografia capilar micelar (ECCM) técnica híbrida Utiliza-se eletrólitos contendo conc. elevadas de surfactantes a ponto de formarem micelas (carga neg.) Espécies positivas movem-se mais lentamente Espécies neutras sofrem partição entre as micelas e a fase aquosa do tampão (migração intermediária) Espécies negativas são repelidas pelas micelas e migram mais rapidamente VANTAGEM SOBRE CLL: Maior eficiência de separação

21 Vantagens e desvantagens VANTAGENS: Elevada frequencia analítica (rapidez) Versatilidade Baixo custo - Baixo consumo de amostras, reagentes e solventes Desempenho analítico satisfatório - Excelentes separações e resoluções Possibilidade detecção on line DESVANTAGENS: Não se aplica a todos os tipos de compostos, como: - Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar (adequados para CG) - Polímeros iônicos de massa molar alta

22 Referências Skoog, D. A., Holler, F. J.;.;Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis 5 th ed., Saunders College Publishing, 1998 Harris, D. C. Análise Química Quantitativa 7 a ed.,ltc LivrosLivros Técnicos e Científicos Editora, 2008 Grossman, P. D.; Colburn. J. C. Capillary Electrophoresis. Theory and Practice Academic Press Inc., 1992 Queiroz, SCN; Jardim, ICSF; EletroforeseCapilar, Chemkeys, 2001 Tavares, MFM; Eletroforese Capilar: Conceitos Básicos, Quim. Nova, 19 (1996) 173

23 Questões 1- Defina eletroforese capilar e explique o que é o fluxo eletroosmótico. 2- Em relação ao sinal analítico, qual é o perfil esperado para um eletroferograma? Justifique. 3- Cite duas fontes de alargamento de banda na eletroforese capilar e comente como este problema pode ser minimizado.

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