Introdução à LC/MS. Introdução

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1 Introdução à LC/MS Introdução n LC provém a separação, em fase líquida, de misturas complexas, porém dificilmente fornece a identificação positiva de componentes individuais. n MS é uma técnica que auxilia na elucidação estrutural de compostos em fase gasosa, porém dificilmente é apropriado para a análise de misturas. n LC opera em fase líquida enquanto que MS opera em fase gasosa, sob alto vácuo. 1

2 Introdução n O uso de uma interface é necessário para ter compostos seqüencialmente separados em LC e introduzidos para análise no MS. n Um bom sistema LC/MS pode fornecer informações quali e quantitativas, geralmente com diminutas quantidades de material. Cromatografia Líquida 2

3 Espectrometria de Massas Misturas em MS 3

4 Combinando LC com MS Aquisição dos Dados Velocidade de varredura 4

5 Aquisição dos Dados Número de espectros por pico Melhorando os Resultados Obter a maior eficiência possível 5

6 Melhorando os Resultados Apresentação de cromatograma de íon selecionado Melhorando os Resultados Monitoramento de íon selecionado (SIM) 6

7 Sumário n O interfaceamento de LC com MS resulta em um instrumento poderoso de LC/MS que pode ser usado para análises de misturas complexas, originada de fontes mais variadas. n Aplicações de interesse nas áreas de meio ambiente, arqueologia, medicina e forense, além de química e bioquímica. Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas LC/MS n Espectrometria de Massas n Interfaces n Analisadores de Massas 7

8 I. Espectrometria de Massas (MS) n A espectrometria de massas é uma técnica analítica instrumental utilizada para a análise, em fase gasosa, de átomos ou moléculas de uma amostra que são ionizados e separados de acordo com a razão massa/carga quando submetidos a condições específicas de um campo elétrico e/ou magnético. I. Espectrometria de Massas (MS) n A determinação da massa molecular; n A caracterização estrutural; n O estudo da reatividade em fase gasosa; n A análise qualitativa e quantitativa dos componentes de uma mistura complexa; n A estrutura de compostos inorgânicos, orgânicos e biológicos; n A estrutura e composição de superfície sólida; n A razão isotópica de átomos na amostra. 8

9 II. O Espectrômetro de Massas n Processo de ionização e/ou fragmentação n Separação dos íons n Detecção e análise Amostra Sistema de introdução de amostra Fonte de íons Analisador de massas Detector Sistema de vácuo Proc. de dados Etil benzeno: MM = 106 Da C 6 H 5 CH 2 CH 3 + e - C 6 H 5 CH 2 CH e - 9

10 Informações do Espectro de Massas n Separação dos íons pela razão massa/carga n Pico do íon molecular n Pico do íon base () n Padrão de fragmentação n Razão isotópica III. Fontes (Processos) de Ionização Tipo Nome e Sigla Agente Ionizante Básico Fase Gasosa Impacto Eletrônico (EI) elétrons energéticos Ionização Química (CI) íons gasosos Ionização de Campo (FI) eletrodo alta voltagem Dessorção Dessorção de Campo (FD) eletrodo alta voltagem Ionização electrospray (ESI) alto campo elétrico Ionização/dessorção à laser feixe de laser assistido por matriz (MALD/I) Bombardeamento de átomos rápidos (FAB) feixe átomos acelerados Ionização termospray (TS) alta temperatura 10

11 Impacto Eletrônico ou Ionização por Eletrons n A amostra passa por uma cortina de elétrons acelerados por um campo de 70 ev E = 70 ev kj mol -1 n Energia de ligação típica kj mol -1 Fragmentação Impacto Eletrônico 11

12 Ionização por Elétron J Alta produção de íons - boa sensibilidade J Fragmentação auxilia na identificação K Requer amostra volátil L Pico íon molecular nem sempre é evidente Uso de Ionização Química (CI): produção de íon molecular e a fragmentação é mais amena Reprodutibilidade de fragmentação 12

13 Ionização à Pressão Atmosférica (API) n Ionização Electrospray (ESI) n Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI) Vantagens API n Informação sobre a massa molecular (MM) dos compostos, inclusive grandes biopolímeros. n Sensível; MM obtida com concentrações baixas de analitos. n A técnica é compatível com moléculas voláteis, não voláteis, polares e apolares. n Excelente para confirmação de compostos conhecidos. 13

14 Ionização por Electrospray (ESI) n Ionização à pressão atmosférica e temperatura ambiente n Aplicação de campo elétrico de vários kv promove a ionização das gotículas do spray n Um contra fluxo de gás secante reduz o tamanho das gotículas até o seu colapso eletrostático n Produção de íons com elevado número cargas Interface ESI 14

15 Processo de Ionização Aplicações do ESI q Análise de compostos polares e com elevada massa Molecular. Por Exemplo: Saponinas H 3 C CH 3 OH CH 3 CH 3 OH O H 3 C O HO O O H C H 3 OH O O H HO O O O H OH O O H OH H 15

16 sep1112fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9)) Scan ES e sep1112fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9)) Scan ES e5 sep1124fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) Scan ES e sep1124fs (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) Scan ES e5 sep16rfs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ES e sep16rfs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ES sep1162fs 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) Scan 2.21e5 ES e sep1162fs 0 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) Scan ES sepfreu2026fs 10 (0.494) Cm (7:13) Scan 1.81e5 ES e sepfreu2026fs 0 10 (0.494) Cm (7:13) Scan ESsepha1149Fs (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8)) Scan 3.90e5 ES e5 sep1112fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9)) Scan ES e sepha1149fs 0 28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8)) Scan ES m/z e sep1124fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) Scan ES e m/z sep16rfs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ESsep1112Fs 14 (0.681) Cm (11:28-(31:42+2:9)) Scan ES- 2.21e e sep1162fs 0 13 (0.635) Cm (5:28-(2:5+28:49)) Scan ESsep1124Fs 8 (0.401) Cm (7:11-(1:7+11:23)) Scan ES e e sepfreu2026fs 10 (0.494) Cm (7:13) Scan ESsep16rFs 9 (0.448) Cm (7:18-3:5) Scan ES- 3.90e e sep1162fs sepha1149fs 13 (0.635) 28 (1.336) Cm Cm (5:28-(2:5+28:49)) (9:41-(35:44+1:8)) Scan Scan ES- ES e5 1.81e m/z sepfreu2026fs 10 (0.494) Cm (7:13) Scan ES e Monitoramento da composição de frações obtidas de extratos de Sapindus saponaria Figura 18: Conjunto de espectro de massas das frações eluídas com MeOH/H 2O (1:1). Debaixo para cima: fração 12, 24, 49 e sepha1149fs 28 (1.336) Cm (9:41-(35:44+1:8)) Scan ES- Ionização Química à Pressão 3.46e Atmosférica (APCI) 0 m/z n Bastante similar a ESI n Indicado para obtenção de MM de compostos conhecidos (confirmação de síntese de biblioteca combinatória), porém indução de fragmentação também é possível n Compatível com grande faixa de fluxos de fase móvel n Robusto para desenvolvimento de método 16

17 Interface APCI Principais Diferenças entre APCI e ESI n Mecanismo de Ionização: n Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta do spray, APCI apresenta um nebulizador aquecido e pneumaticamente assistido. A voltagem (~3 kv) é aplicada a uma agulha de metal na saída do spray. n A descarga Corona ioniza as moléculas do solvente que por sua vez ionizam os analitos por transferência de prótons formando [M+H] + ou [M-H] - 17

18 Principais Diferenças entre APCI e ESI n Razão de Fluxo: n APCI tolera fluxos na ordem de 0,2 a 2,0 ml/ min, enquanto que ESI opera no máximo até 1,0 ml/min. n ESI é melhor indicado para fluxos tão baixos quanto 5 µl/min, compatível com acoplamentos capilares (µlc ou CZE). Principais Diferenças entre APCI e ESI n Fragmentação: n Devido ao uso de aquecimento, APCI pode produzir alguma fragmentação, enquanto que ESI pode até formar alguns íons pseudomoleculares. n APCI não produz cargas múltiplas, portanto não é adequado para compostos de alta MM. n Sensibilidade: n Sem ser uma regra, APCI tende a render melhor sensibilidade para solutos menos polares. 18

19 Dessorção/Ionização à Laser Assistida com Matriz (MALD/I) n Processo de ionização branda. n Apropriado para biomoléculas de elevado peso molecular. n Pulso de laser incide sobre uma amostra cocristalizada com uma matriz apropriada - derivados de ácidos benzóicos. n Análise proteômica. Dessorção/Ionização à Laser Assistida com Matriz (MALD/I) 19

20 Espectro MALD/I IV. Analisadores de Massas n Setor magnético (B) n Duplo foco (EB ou B 2 ) n Quadrupolo (Q) n Tempo de vôo (TOF) n Captura de íons (MS n ) n Ciclotron de íons (ICR) 20

21 Resolução em MS Nome Fórmula Nominal Exata Média Methyl C19H38O Stearate Ubiquitin C378H630N105O118S R S = m Δ m R S = ,0 e 400,1 (40,00 e (40,01) Resolução em MS 21

22 Resolução em MS A resolução necessária depende da aplicação Analisador tipo Setor Magnético m z = 2 2 B r e 2V 22

23 Analisador Quadrupolar (Q) n Analisador de varredura n Normalmente é mais barato e robusto que setor magnético n Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que alternam sinais de radiofreqüência entre pares, permitindo que apenas um íon atinja o detetor de cada vez Analisador Quadrupolar (Q) 23

24 Analisador Quadrupolar (Q) Analisador Quadrupolar (Q) 24

25 Analisador Quadrupolar (Q) Experimentos de MS/MS com triplo quadrupolo Analisador Quadrupolar (Q) 25

26 Tempo de Vôo (TOF) n Íons são produzidos em pulsos e injetados no tubo de deslocamento Tempo de Vôo (TOF) 26

27 Tempo de Vôo (TOF) n Separação dos íons é temporal e depende da energia cinética dos fragmentos t f = d = d (1 2) V v m z m z = 2 2 1,9 V t d Analisador Trap Iônico (ion trap) n Compacto & robusto n Funcionamento similar ao quadrupolo n Capacidade de efetuar MS tandem temporal 27

28 Analisador Trap Iônico (ion trap) 28

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