INFUSÃO DE PADRÕES ANALÍTICOS EM SISTEMA MS/MS: OTIMIZAÇÃO DE PARÂMETROS ELETRÔNICOS
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- Luísa Benedita da Silva Malheiro
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1 INFUSÃO DE PADRÕES ANALÍTICOS EM SISTEMA MS/MS: OTIMIZAÇÃO DE PARÂMETROS ELETRÔNICOS PAIVA, Alexandre K. 1 ; MASUNARI, Andrea 2 1 Discente do curso de Farmácia do Centro Universitário São Camilo. São Paulo, SP. - Bayer S.A. (Laboratório de Segurança Alimentar) 2 Docente do curso de Farmácia do Centro Universitário São Camilo. São Paulo, SP. a.kosilek@gmail.com Palavras-Chave: ESPECTROMETRIA DE MASSAS. AGROTÓXICOS. QUÍMICA ANALÍTICA. INTRODUÇÃO Em 1798, Thomas Malthus apresentou a teoria de que o crescimento populacional exponencial iria ultrapassar a capacidade de produção de alimentos, prevendo fome, doenças e altos níveis de mortalidade. Entretanto, a hipótese de Malthus desconsiderou um fator importante: os avanços da ciência e da tecnologia para otimizar a produtividade e superar os limites impostos pela quantidade finita de áreas cultiváveis (POSTEL, 1998). O desenvolvimento de compostos químicos utilizados para a manutenção de parcelas agrícolas foi um dos fatores que levaram ao aumento da produção mundial de alimentos (POSTEL, 1998). Apesar dos evidentes benefícios proporcionados pelos agrotóxicos à produção agrícola, o risco de intoxicações preocupa seriamente as autoridades reguladoras. Frente ao exposto, foi determinado um Limite Máximo de Resíduos, definido legalmente pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) como a quantidade máxima de agrotóxico aceita no alimento, desde sua produção até o consumo, sendo expresso em miligramas de resíduo por quilograma de alimento (PITELLA, 2009). Como o monitoramento de contaminantes é indispensável, são necessárias técnicas analíticas sensíveis que possam detectar níveis de agrotóxicos na escala de nanogramas e que permitam a separação de diversos compostos, já que os extratos provenientes de alimentos são complexos e possuem diversos interferentes que resultam em problemas durante a análise (PITELLA, 2009). A descoberta da espectrometria de massas (MS) no final do século XIX resultou em uma revolução na análise química e estrutural de compostos em diversas áreas da ciência. Atualmente, a espectrometria de massas é uma das técnicas mais utilizadas em laboratórios devido à sua precisão e por fornecer informações específicas das amostras, como a composição elementar, a estrutura molecular e as composições qualitativa e quantitativa de misturas complexas (RODRIGUEZ, 2003). Por meio do acoplamento de um sistema de HPLC (High Performance Liquid Chromatography) como injetor de amostras ao sistema de MS/MS, os laboratórios realizam análises de alta especificidade analítica em modo de MRM (Multiple Reaction Monitoring). Esta técnica é amplamente empregada na detecção de compostos orgânicos presentes em baixas concentrações em matrizes complexas, como por exemplo a análise de resíduos agrotóxicos em matrizes vegetais. Citam-se como vantagens desta técnica, um sensível aumento da sensibilidade de detecção e redução de interferentes ao sinal do analito em função da melhor separação dos compostos em solução (WENTZ, 2010; CHIARADIA, COLLINS e JARDIM, 2008). OBJETIVOS Realizar a infusão de soluções de Ethoxysulfuron e Fenamidone (padrões primários) em sistema MS/MS de forma a otimizar os parâmetros eletrônicos especificados a seguir: DP
2 (Declustering Potential), EP (Entrance Potential), CE (Collision Energy) e CXP (Collision Cell Exit Potential). METODOLOGIA Utilizando-se um Espectrômetro de Massas API 4000 QTRAP com sistema MS/MS e ionização em ESI (Electronspray Ionization), procedeu-se conforme determinado no Manual do Software Analyst no capítulo 7. Modos de Varredura Triplo Quadrupolo. Preencheu-se uma seringa com 200 ng/ml dos agrotóxicos Ethoxysulfuron e Fenamidone em uma solução de proporção 50:50 das fases móveis: Fase Móvel A: Água tipo 1: Metanol (9:1; v/v) + 10mM de Formiato de Amônio + 120μL de Ácido Fórmico; Fase Móvel B: Água tipo 1: Metanol (1:9; v/v) + 10mM de Formiato de Amônio + 120μL de Ácido Fórmico; Realizou-se então a verificação da posição do spray, orientando-o manualmente na posição vertical 10 e horizontal 5. Acoplou-se a seringa em um pick plástico ao sistema de canais para infusão direta no sistema MS/MS e então posicionou-se a seringa em uma bomba de infusão com fluxo de 10 μl/min. Iniciou-se a infusão deixando o fluxo correr por 2 minutos, de forma a preencher os canais com a solução e permitir a estabilização do fluxo. Selecionou-se o modo Tune no software e se procedeu com o modo de varredura em Q1 MS Scan, selecionando a polaridade para modo positivo. Realizou-se então o cálculo da massa molecular exata dos dois compostos na opção Calculators do software, de forma a introduzir uma faixa de varredura de massas ao modo Q1 MS Scan em 10 ciclos. O valor inicial de DP foi definido para 80 volts (default). Após obtenção do espectro de Q1, selecionou-se o modo Q1 Multiple Ions (MI) Scan. Realizou-se a rampa de DP e EP para os dois compostos, de forma a obter o valor ótimo para a entrada no filtro de massas Q1. A seguir, mudou-se o modo para Product Ion (MS/MS) Scan e, digitando no campo Product Of a massa do íon molecular precursor a ser fragmentado, foram obtidas as rampas de CE e CXP e os dois principais fragmentos formados na célula de colisão Q2. Com a otimização de todos os parâmetros de voltagem, realizou-se o teste de paternidade dos compostos, para verificar se os fragmentos formados eram realmente oriundos do íon molecular conhecido. Selecionou-se o modo Precursor Ion Scan e no campo Precursor Of digitou-se a massa do fragmento. Após confirmação de paternidade, encerrou-se o procedimento analítico pela realização do Multiple Reaction Monitoring (MRM). RESULTADOS Os dados obtidos com a infusão em MS/MS foram compilados nas tabelas e gráficos apresentados a seguir. A Tabela 1 apresenta as massas exatas calculadas pelo software Analyst, enquanto a Tabela 2 resume os resultados obtidos ao final da infusão: parâmetros eletrônicos otimizados e os fragmentos e íons moleculares obtidos. É representado também o espectro de compostos filtrados em Q1 (Figura 1) e o MRM obtido ao final da infusão, com avaliação de intensidade após otimização individual dos parâmetros (Figura 2).
3 Tabela 1 - Massas Exatas obtidas para Ethoxysulfuron e Fenamidone: Molécula Massa Exata (Da) Ethoxysulfuron 398,0896 Fenamidone 311,1092 Figura 1 - Q1 MS Scan da Solução de Ethoxysulfuron e Fenamidone (200 ng/ml): Ethoxysulfuron: [M+H] + = Fenamidone: [M+H] + = Tabela 2 Parâmetros Eletrônicos otimizados para Ethoxysulfuron (399.2), Fenamidone (312.1) e seus fragmentos obtidos em Q2: Fragmento (Da) DP (Volts) EP (Volts) CE (Volts) CXP (Volts) [M+H] [M+H]
4 Figura 2 MRM de Ethoxysulfuron e Fenmidone: DISCUSSÃO Após a infusão das soluções dos padrões primários de Ethoxysulfuron e Fenamidone no sistema MS/MS foi possível otimizar manualmente os parâmetros de voltagem (DP, EP, CE e CXP) relacionados à entrada dos compostos no detector Q1, fragmentação em Q2, transição de Q2 para Q3, respectivamente. As transições de fragmentação, nas voltagens definidas, são específicas para cada composto. Com o modo MRM ativo foi possível avaliar a intensidade detectada em Q3 para os 4 fragmentos simultaneamente. A realização de múltiplas reações em Q2 e detecção de diversos fragmentos em Q3, confirma a formação dos íons filhos com as voltagens pré-determinadas e possibilita a detecção mútua ao final do sistema MS/MS em intensidade adequada para quantificação exata e precisa, mesmo na presença de inúmeras moléculas e fragmentos provenientes de matrizes vegetais complexas. CONCLUSÃO Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a metodologia aplicada na otimização dos parâmetros eletrônicos foi efetiva, já que o espectro de MRM apresentou intensidade suficiente para todos os fragmentos e estes puderam ser identificados com alta seletividade em Q3. Os dados serão armazenados e compilados com os dados de futuras infusões. As transições de massa obtidas serão utilizadas em um próximo projeto, que abordará a validação do método QuEChERS para diversas moléculas de agrotóxicos registrados no Brasil em cinco diferentes matrizes vegetais.
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AB SCIEX (Canadá). Modos de Varredura Triplo Quadrupolo. In: AB SCIEX (Canadá). Analyst User's Guide. Ontario: Cap. 7. p CHIARADIA, Mariza C.; COLLINS, Carol H.; JARDIM, Isabel C. S. F.. O Estado da Arte da Cromatografia Associada à Espectrometria de Massas Acoplada à Espectrometria de Massas na Análise de Compostos Tóxicos em Alimentos. Química Nova, Campinas, v. 31, n. 3, p , fev PITTELLA, Carla Martins. Determinação de Resíduos de Pesticidas em Mel de Abelhas (Apis Sp) por Cromatografia de Fase Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Veterinária, Departamento de Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, POSTEL, Sandra L.. Water for Food Production: Will There Be Enough in 2025?. Bioscience, Amherst, v. 48, n. 8, p , ago RODRIGUEZ, Rafael Martinez. Estudo da Emissão de Íons Estáveis e Metaestáveis (LiF)nLi + Induzida por Fragmentos de Fissão do 252 Cf f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Física, Departamento de Departamento de Física, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Cap. 2. WENTZ, Gabriela Negruni. Validação do método analítico para determinação de cloranfenicol em matriz camarão segundo a norma da Comunidade Europeia EC 657/2002, por cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (LC-MS/MS) f. TCC (Graduação) - Curso de Química, Departamento de Instituto de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2010.
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