Espectrometria de Massas
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- Diego Mascarenhas Machado
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1 Componentes de um Espectrômetro de Massas Alto vácuo (10 5 a 10 8 mbar Inlet Fonte de Íons Analisador Detector CG HPLC Bomba Seringa EI CI MALDI ESI APCI Quadrupolo TOF Ion Trap FT-ICR Setor Magnético Sistema de dados Ion Abundance (%) FAB m/z ICP TIS 1
2 Considere os espectros de massas do tributilamina (C 12 H 27 N ; MM = 185 g/mol). (Adaptado de Somogyi: Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques) 2
3 Analisadores Setor Magnético (Adaptado de 3
4 Analisadores - Quadrupolos Espectrômetros de Massas com Quadrupolos (Adaptado de (Adaptado de 4
5 Analisadores Tempos de Vôo Time-of-flight: TOF TOF-MS O TOF-MS baseia-se na medida do tempo que um íon leva para atravessar a fonte de íons até chegar no detector. Ao entrar no TOF, todos os íons recebem um pulso de energia e são acelerados de maneira diferente, em função de suas m/z. Assim, os íons chegam ao detector em tempos diferentes. Os íons com menor m/z possuem maior velocidade e chegarão primeiro ao detector. Pode-se analisar compostos de massa baixa e até macromoléculas. 5
6 Analisadores Tempos de Vôo Time-of-flight: TOF TOF-MS Mais sensível que o quadrupolo, pois tudo que entra no analisador chega ao detector. Apenas 25% dos íons que chegam ao quadrupolo, conseguem atingir o detector. Não possui elevada resolução. Quanto maior a distância, melhor será a resolução. 6
7 Analisadores Tempos de Vôo Time-of-flight: TOF TOF-MS 7
8 Analisadores Tempos de Vôo Time-of-flight: TOF TOF-MS 8
9 Analisadores Tempos de Vôo Time-of-flight: TOF TOF-MS 9
10 Analisadores Analisadores de Massas TOF Tempos de Vôo Time-of-flight - TOF 10
11 (Adaptado de Somogyi: Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques) 11
12 Analisadores Analisadores de Massas TOF Tempos de Vôo Time-of-flight - TOF (Adaptado de High-Definition-Mass-Spectrometer/images/Synapt_API_lg.jpg) 12
13 Analisadores Analisadores de Massas TOF vs Quadrupolo (Adaptado de 13
14 Componentes de um Espectrômetro de Massas Alto vácuo (10 5 a 10 8 mbar Inlet Fonte de Íons Analisador Detector EI CI Quadrupolo Setor Magnético Sistema de dados MALDI ESI TOF Amostras voláteis e termicamente estáveis. Ion Abundance (%) m/z Biomoléculas possuem massas > Da e são termicamente sensíveis. 14
15 Fontes de Dessorção Ao contrário das fontes de ionização, as fontes de dessorção dispensam a volatilização seguida da ionização. Introduz-se energia em variadas formas na amostra líquida ou sólida, com o objetivo de causar a formação direta dos íons gasosos. Possibilita a obtenção de MS de espécies termicamente sensíveis (instáveis termicamente) e espécies com MM > Da. 15
16 Fontes de Dessorção Considere os MS do ácido glutâmico (Massa nominal = 147 ; m/z = 147). EI Dessorção (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental 16
17 Fontes de Dessorção Dessorção-Ionização a Laser Assistida por Matriz Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization MALDI O analito presente em baixas concentrações é, uniformemente disperso em uma matriz sólida ou líquida, na qual é depositada na extremidade de uma sonda de aço inox ou colocada sobre uma placa metálica. Esta placa é colocada em uma câmara a vácuo, e um feixe de laser é focalizado na amostra. Além da câmara a vácuo, há possibilidade de se trabalhar com MALDI a pressão atmosférica. Tem sido empregado para obtenção de informações exatas das MM de biopolímeros polares, com massas de alguns milhares a centenas de milhares de Da. 17
18 Fontes de Dessorção Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization MALDI (Adaptado de (Adaptado de 18
19 Fontes de Dessorção Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization MALDI (Adaptado de 19
20 (Adaptado de Somogyi: Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques) 20
21 (Adaptado de Somogyi: Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques) 21
22 (Adaptado de Somogyi: Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques) 22
23 Fontes de Dessorção Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization MALDI (Adaptado de 23
24 Fontes de Dessorção Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization MALDI Considere os MS do anticorpo monoclonal de um rato. Matriz: ácido nicotínico. (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental) 24
25 Fontes de Dessorção MALDI Determinação da proteína IL 5 MAB (MM = Da) por MALDI. M ++ M + H + (Adaptado de HPLC for Pharmaceutical Scientists) 25
26 Fontes de Dessorção MALDI Imaging Mass Spectrometry IMS (Adaptado de 26
27 Imaging Mass Spectrometry IMS (Adaptado de 27
28 Fontes de Dessorção MALDI Imaging Mass Spectrometry IMS (Adaptado de 28
29 Fontes de Dessorção MALDI Imaging Mass Spectrometry IMS (Adaptado de 29
30 Fontes de Dessorção Ionização por Eletronebulização Eletrospray Ionization ESI Eletrospray Ionization Mass Spectrometry ESI/MS Uma solução da amostra é bombeada através de uma agulha capilar de aço inox a uma vazão de poucos µl/minuto. A nuvem carregada resultante é constituída de finas partículas. Estas passam através de um capilar de dessolvatação, onde ocorre a evaporação do solvente e a ligação da carga às moléculas do analito. Como consequência desta evaporação, as gotículas tornamse menores e assim, as densidades de carga tornam-se maiores até o ponto em que a tensão superficial não suporta a carga (LIMITE DE RAYLEIGH). Neste ponto ocorre a divisão das gotas em gotículas menores (EXPLOSÃO COULOMBICA). 30
31 Fontes de Dessorção Eletrospray Ionization ESI As gotículas provenientes da explosão coulombica continuam o processo até que todo o solvente seja removido, resultando em uma molécula do analito com carga múltipla. Uma característica bastante útil do ESI é a pouca fragmentação de biomoléculas grandes e termicamente frágeis, uma vez que o analito que está ionizado retém pouca energia excedente. Adicionalmente, os íons formados são de cargas múltiplas, de maneira que seus valores de m/z são suficientemente pequenos para torná-los detectáveis em um instrumento com quadrupolo que trabalha com uma faixa de 1500 ou menos. Esta característica permite, por exemplo, a análise de proteínas e outras biomoléculas que possuem MM > Da, como polipepitídeos e oligonucleotideos. 31
32 Fontes de Dessorção Eletrospray Ionization ESI (Adaptado de 32
33 Fontes de Dessorção Eletrospray Ionization ESI modo positivo neb. = 0 V C.N. = 3500 V modo negativo neb. = 0 V C.N. = 3500 V Onde neb. = Nebulizador e C.N. = Câmara de Nebulização. (Adaptado de (Adaptado de 33
34 (Adaptado de Somogyi: Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques) 34
35 (Adaptado de Somogyi: Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques) 35
36 Eletrospray Ionization ESI MW calculada = ± 2 Da. 36
37 Fontes de Dessorção Eletrospray Ionization ESI (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental) 37
38 Fontes de Dessorção Eletrospray Ionization ESI Determinação de cocaína e seus produtos de degradação e adulterantes, por HPLC-DAD e confirmação por HPLC-ESI-MS. (Adaptado de Forensic Science International 235 (2014) 32 39) 38
39 Fontes de Dessorção Eletrospray Ionization ESI M + H + M + H + (Adaptado de Forensic Science International 235 (2014) 32 39) 39
40 Fontes de Dessorção Eletrospray Ionization ESI M + H + M + H + M + H + M + H + M + H+ (Adaptado de Forensic Science International 235 (2014) 32 39) 40
41 Fontes de Dessorção Eletrospray: ESI Determinação de Verapamil (M 1 ) e peptídeo (M 2 ) em uma mistura, por ESI-MS, modo positivo. M 1 + H + M 1 + Na + M2 + H + M 2 + Na + (Adaptado de HPLC for Pharmaceutical Scientists) 41
42 Fontes de Dessorção Eletrospray: ESI Determinação de Everminomicin (SCH 27899, oligosacarídeo e antibiótico extraído por fermentação do Micromonospera carbonacea) por ESI-MS, modo negativo. MW = 1629 M H = 1628 C 70 H 96 O 38 NCl (Adaptado de HPLC for Pharmaceutical Scientists) 42
43 Fontes de Dessorção Eletrospray: ESI Determinação da proteína IFN α 2b (MM = ,3 Da) por ESI-MS, modo positivo. (Adaptado de HPLC for Pharmaceutical Scientists) 43
44 Fontes de Dessorção Eletrospray: ESI Determinação da proteína IFN α 2b (MM = ,3 Da) por ESI-MS, modo positivo. (Adaptado de HPLC for Pharmaceutical Scientists) 44
45 Fontes de Dessorção Eletrospray: ESI rh GM CFS: Glicóproteína que regula a proliferação de células no sangue. Esta pode ser clonada a partir do E. coli, cujo derivado apresenta 127 aminoácidos e MM ~ ,6 Da). m/z (Adaptado de HPLC for Pharmaceutical Scientists) 45
46 Fontes de Dessorção Eletrospray: ESI 46
47 Fontes de Dessorção Eletrospray: ESI 47
48 Espectrometria de Massas Sequencial MS-MS As duas substâncias abaixo possuem m/z = 279. Como analisá-las por MS? Na MS-MS, uma fonte de ionização (geralmente mole) produz íons e alguns fragmentos. Estes fragmentos são introduzidos no 1 analisador de massas, que seleciona um determinado íon (ÍON PRECURSOR) e o envia para a célula de interação, onde pode sofrer decomposição espontânea, interagir com gás de colisão ou interagir com um feixe de laser para produzir fragmentos (ÍONS PRODUTO). Estes fragmentos são analisados pelo 2 analisador e detectados pelo detector de íons. 48
49 Espectrometria de Massas Sequencial MS-MS (Adaptado de 49
50 (Adaptado de Somogyi: Mass Spectrometry Instrumentation and Techniques) 50
51 Espectrometria de Massas Sequencial MS-MS Considere os espectros do Dibutilftalato e da Sulfametazina. Dibutilftalato Sulfametazina MM = 278,3435 MM = 278,
52 Espectrometria de Massas Sequencial MS-MS (Adaptado de Skoog. Principios de Análisis Instrumental) 52
53 (Adaptado de Food Chemistry 160 (2014) ) 53
54 Espectrometria de Massas Sequencial MS-MS (Adaptado de 54
55 Espectrometria de Massas Sequencial MS-MS Separation by LC enables individual tandem-ms spectra acquisition for individual glycan structures. (Adaptado de Nature Protocols 7, (2012) ) 55
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