Espectrometria de massa & análise de biomoléculas
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- Rayssa Benevides Galindo
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1 Espectrometria de massa & análise de biomoléculas Curso de Inverno 16/07/2012 Sayuri Miyamoto Tópicos I. Breve Introdução II. Espectrômetros de Massa III. Aplicações em Análise de Biomoléculas 1
2 Os primeiros espectrômetros de massa :Estabelecimento da técnica de espectrometria de massa : TOF 1955: Quadrupole 1983: Ion Trap 1968: MS/MS Joseph John Thomson United Kingdom University of Cambridge 1897 Descobre o elétron e determina seu m/z 1912 Constroi o primeiro espectrômetro de massa e obtem o espectro de O 2, N 2, CO, CO 2 Francis William Aston United Kingdom University of Cambridge 1919 Espectro de Massa de Isótopos de Elementos Wolfgang Paul Federal Republic of Germany University of Bonn Nobel Prize in Chemistry 2002 John B. Fenn is the chemist who invented the ELECTROSPRAY method (1988). Professor of Chemistry at Yale University, USA, and at Virginia Commonwealth University, USA Koichi Tanaka research engineer who developed the MALDI technique (1987). Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan. 2
3 John B. Fenn NOBEL LECTURE Electrospray Wings for Molecular Elephants Espectrometria de Massas Espectrometria de massas é uma técnica que permite a pesagem de moléculas. Obviamente a pesagem não é feita através de uma balança e sim através de um equipamento chamado de espectrômetro de massa. 3
4 Tabela Periódica MASSA ATÔMICA: é dado pelo número de prótons e neutrôns de um átomo e a sua unidade é unidade de massa atômica ou simplesmente u (1u=1Da). Importante: a massa atômica = massa média dos isótopos Massa: Conceitos Importantes Massa nomimal: massa calculada a partir da massa do isótopo natural mais abundante de cada elemento, arredondada para o valor inteiro Massa média: massa calculada usando-se a massa atômica média de cada elemento, a qual é obtida ponderando-se a massa dos isótopos naturais Massa exata (massa teórica): massa calculada usando-se a massa de um isótopo específico. Isóbaros: átomos ou moléculas com a mesma massa nominal, porém com massas exatas diferentes. Vessecchi et al 2011 Nomenclaturas de espectrometria de massas em língua portuguesa. Química Nova vol. 34, pag
5 Abundância Relativa (%) 16/7/2012 Isótopos e suas Massas Elemento H 1 2 C N O Massa Nominal Massa Exata Abundância Relativa % % 98.90% 1.10% 99.64% 0.36 % 99.76% 0.04% 0.20% Massa Média P % S % 0.75% 4.22% Exemplo de Massas de Compostos Orgânicos Ácido Linoleico Ubiquitina Molecular formula: C 18 H 32 O 2 C 378 H 630 N 105 O 118 S Massa Nominal Massa Média: Monoisotopic mass: Pesticide Mix 100 Pico monoisotópico % Picos isotópicos m/z m/z 5
6 Resolução Expressa o grau de separação entre dois picos Determina a precisão da massa determinada m m=fwhm R = m/ m FWHM = Full Width of the Peak at Half its Maximum Largura Total do Pico na Metade de sua Altura Maior Resolução Maior Precisão m/z (monoisotopic mass of the protonated bradykinin ion) 6
7 Tópicos I. Breve Introdução II. Espectrômetros de Massa III. Aplicações em Análise de Biomoléculas Ion-Trap Q-TOF (Micro-TOF) Q-TOF de Alta Resolução (Maxis) MALDI-TOF Equipamentos disponíveis na Central Analítica (IQ-USP) 7
8 Espectrômetro de massa O que ele mede? Espectrômetro de massa NÃO MEDE MASSA. Espectrômetro mede a Relação MASSA/CARGA (m/z). Como ele mede? A medida é baseada na movimentação de uma partícula carregada, chamada ÍON, em um campo elétrico ou magnético. Essa movimentação ocorre em FASE GASOSA e no VÁCUO e é afetada pela razão massa/carga (m/z). Espectrômetros de massa Componentes básicos: 1. Fonte de íons 2. Analisador de massas 3. Detector Vácuo 1.Fonte de íons íons 2.Analisador de Massas íons 3.Detector de Íons Entrada da Amostra Gas (GC-MS) Líquido (LC-MS) Sólido (MALDI) Espectro de massa 8
9 Fonte de Íons (Ion Source) EI/CI ESI MALDI Ionização por Elétrons Ionização Química Ionização por Electrospray Ionização/Dessorção a Laser assistida por Matriz Electrospray Ionization (ESI) a Dessolvatação Formação de gotículas carregadas Formação de íons com múltiplas cargas 9
10 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) (337 nm) Amostra é co-cristalizada juntamente com uma MATRIZ. Koichi Tanaka, Nobel Prize 2002 A matriz absorve a energia, a qual é utilizada para a vaporização e transferência da molécula para a fase gasosa. Voet Biochemistry 3e 2004 John Wiley & Sons, Inc. Voet Biochemistry 3e 2004 John Wiley & Sons, Inc. 10
11 Análise de Citocromo c ESI MALDI Íons com Cargas Múltiplas Transformation Maximum Entropy 11
12 Fonte de Íons (Ion Source) EI/CI ESI MALDI Técnica de ionização mais antiga ainda muito utilizada em GC-MS. A amostra na fase gasosa é bombardeada com um feixe de elétrons (entre ev). Muitos fragmentos!! Técnica bastante branda de ionização. Permite análise de ampla gama de compostos. Analitos com múltiplas cargas. Acoplamento com LC (LC-MS), eletroforese capilar, etc. Análise direta de analitos em sólidos. Ionização produz íons monocarregados. Espectros de fácil interpretação. Analisadores de Massa Quadrupole TOF Ion Trap Orbitrap Mag. Sector FTMS 12
13 QUADRUPOLE Amplamente utilizado. Íons são acelerados através da aplicação de uma diferença de potencial. A dinâmica de movimentação do íon através das barras depende de uma radiofrequência (RF). O valor da massa é resultado dos valores de radiofrequência (RF) e de correntes (DC) aplicados. Ion-Trap: Aprisionamento de Íons Enquanto no Quadrupolo a campo aplicado é bidimensional no Ion-Trap o campo é tridimensional. Aprisionamento de ions. Permite acúmulo de íons: Ganho de sensibilidade. Vantagem: MS n!! 13
14 TOF (Linear) Íons são acelerados através da aplicação de uma diferença de potencial. Íons percorrem uma distância fixa. Separação das massas por Tempo de Vôo. Vantagem: Massas com alta resolução. TOF (Refletor) íons são refletidos No Refletor após os íons percorrerem uma distância eles entram em um campo eletrostático que funciona como um espelho. Os íons são refletidos. O Refletor corrige pequenas diferenças na migração de massas com a mesma massa e essa correção aumenta bastante a resolução do sinal. 14
15 Analisadores de Massa Quadrupole TOF Ion Trap Orbitrap Mag. Sector FTMS Quantificação Caracterização/Identificação Altíssima Resolução e Precisão!! Analisadores de Massa Quadrupole TOF Ion Trap Orbitrap Mag. Sector FTMS 15
16 Espectrômetro de Massa em Tandem MS/MS Tandem Mass Spectrometry Diferentes configurações de MS-MS: Quadrupole-quadrupole: Triple-quadrupole Quadrupole-time-of-flight: Q-TOF Time-of-flight-time-of-flight: TOF-TOF É possível realizar fragmentações em equipamentos com um único analisador. Ex: Ion trap e TOF com post-source decay 16
17 Triplo-Quadrupolo Q1 Q2 Q3 Voet Biochemistry 3e Page John Wiley & Sons, Inc. Caracterização/Identificação Análise de classes de compostos Análise de classes de compostos Análise de alta especificidade Ganho de sensibilidade Quantificação 17
18 Tópicos I. Breve Introdução II. Espectrômetros de Massa III. Aplicações em Análise de Biomoléculas METABOLÔMICA Ácidos Nucleicos Espectrometria de Massas Proteínas Proteômica Lipídeos Lipidômica Carboidratos 18
19 Absolute Intensity 16/7/2012 Aplicações em Análise de Proteínas Identificação e confirmação de proteínas Detecção de modificações pós-traducionais. Sequenciamento de novo de peptídeos Monitoramento de complexos de Proteínas-Ligantes. Determinação da pureza de proteínas/confirmação da Identidade A SDS-PAGE (4 12% gradiente) kda M Extrato Bruto B MALDI-TOF mass spectrometry m/z Fração de Proteínas Solúveis Fracionamento Salino Cromatografia de Filtração em Gel Cromatografia de Afinidade Armengaud et al. BMC Structural Biology :3 doi: /
20 Identificação de Proteínas Sequenciamento de Peptídeos 20
21 Análise de Modificações em Proteínas Published in: Carlos A. O. Sigolo; Paolo Di Mascio; Marisa H. G. Medeiros; Chem. Res. Toxicol. 2007, 20, DOI: /tx700111v Copyright 2007 American Chemical Society MALDI-TOF mass spectra showing protein modification of 270 µm cytochrome c incubated for different time periods with 18 mm DDE at 37 C and ph 7.4. (A) Cytochrome c (control, without DDE) and cytochrome c incubated with DDE for (B) initial time, (C) 1 h, (D) 2 h, and (E) 4 h. 21
22 Aplicações em Análise de Lipídeos Análise Lipidômica Análise de Lipídeos modificados Estudos mecanísticos Identificação/quantificação de marcadores de peroxidação lipídica (Biomarcadores ) Análise Lipidômica LC LC-ESI-MS/MS MS1 CID MS2 22
23 Nature Reviews Molecular Cell Biology 11, (August 2010) Análise do Perfil de Fosfolipídeos de cérebro de rato por ESI-MS no modo negativo MS1- Scan Fosfolipídeos 23
24 Fragmentos de m/z 885 Fosfatidil-Inositol 18:0-20:4 Resumo Espectrometria de massas é uma técnica poderosa que permite: Determinar a massa molecular Caracterizar a estrutura de compostos desconhecidos Verificar a identidade e a pureza de substâncias Quantificar de forma específica e sensível diversos compostos 24
25 REFERENCES Mass Spectrometry: Principles and Applications 3rd Edition (2007) Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant Introduction to Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation. 4th Edition (2007) J. Throck Watson, O. David Sparkman Obrigada pela Atenção Laboratório de Pesquisa de Lipídeos Modificados 25
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