Aula 8: Métodos de Purificação de Proteínas Recombinantes

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1 Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas Curso de Ciências Biológicas 1º Semestre de 2015 Aula 8: Métodos de Purificação de Proteínas Recombinantes Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

2 Disciplina de Mét. Purif. e Anál. Proteínas Curso de Ciências Biológicas 1º Semestre de 2015 Agradecimentos à Flávia (Depto. Tecnologia) por alguns slides Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

3 Estratégia Geral para Obtenção da Proteína Purificada Extração Isolamento 1. Material de Partida Extrato Bruto 2. Desintegração celular Separação Fracionamento Solubilidade Tamanho Carga Afinidade Ligação Diálise Ultra filtração Coluna Cromatografica

4 Cromatografia em coluna

5 Gel-Filtração A separação e feita de acordo com o tamanho molecular

6 Cromatografia de troca iônica

7 Cromatografia de Afinidade Pequenas proteínas são ligadas aos suportes e a mistura complexa de proteínas é aplicada Proteínas ligadas podem ser eluídas com moléculas pequenas ou reagentes

8 0.25 M NaSCN Gradient M NaSCN 1.5 M NaSCN C+ Ind S FT W1 Blue-Sepharose S FT W1 W2 Gradient mm KPO mm KPO Fosfocelulose

9 Como analisar o resultado da purificação? (como visualizar proteínas e determinar a pureza da amostra? Absorbância 280nm SDS-PAGE

10 Como analisar o resultado da purificação? (como visualizar proteínas e determinar a pureza da amostra? Western Blot

11 Coloração com Prata Western Blot Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272: by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

12 Cromatografia de Afinidade

13 Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.

14 Cromatografia de Afinidade Ni-NTA

15 Cromatografia de Afinidade Ni-NTA

16 Cromatografia de Afinidade Ni-NTA Coloração com Coomassie Blue Western Blot

17 Cromatografia de Afinidade Ni-NTA Coloração com Coomassie Blue Western Blot Anticorpos que reconhecem Poli-histidina!!!

18 Como produzir a proteína contendo a cauda de poli-histidina?

19

20 Como produzir a proteína contendo a cauda de poli-histidina?

21 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

22 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

23 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico ou Fonte: Hanning e Makrides, códons para His (CAT ou CAC)

24 Inclusão dos códons de His

25 Expressão Heteróloga de Proteínas

26 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão para Células Sf9

27 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão para Células Sf9

28 Representação Esquemática Vetor de Expressão para Células Humanas

29 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico pet SUMO Promotor forte IPTG induzido Operador lac Sítio de clonagem Repressor lac Proteína fusionada à sequência de SUMOilação

30 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico pex-c-gst Proteína fusionada à Glutationa S- Transferase Purificação usando cromatografia de afinidade (glutationa-agarose)

31 Tags de Fusão de Proteína Comuns

32 Representação Esquemática de um Vetor de Expressão Procariótico pex-c-gst Sítio para a TEV protease Eliminação da cauda de GST após purificação...

33 Eliminação da cauda (nem sempre necessário)

34 Proteínas Recombinantes então resolvem dois problemas comuns da purificação de proteínas nativas: 1 - Abundância 2 - Especificidade pela Coluna Cromatográfica

35 Exemplo: a DNA polymerase γ de Drosophila melanogaster Nativa Recombinante Quilos de ovos de D. melanogaster Extrato Celular Centrifugação diferencial Coluna de Fosfocelulose Precipitação com (NH 4 ) 2 SO 4 Coluna de DNAcelulose Coluna de Octilsefarose Coluna de Blueagarose Sedimentação em Gradiente de Glicerol Expressão em Sf9 Extrato Celular Coluna de Fosfocelulose Precipitação com (NH 4 ) 2 SO 4 Coluna de Ni-NTA Sedimentação em Gradiente de Glicerol

36 Exemplo: a DNA polymerase γ de Drosophila melanogaster Nativa vs Recombinante

37 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa.

38 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Fonte?

39 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Fonte? Extração de humanos? Voluntários? Ética?

40 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Animais modelos Que tecido? Por quê?

41 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Animais modelos Cérebro (Substância negra) Que tipo de extração?

42 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Animais modelos Cérebro (Substância negra) Tampão hipotônico e homogenizadores para tecidos moles Onde parkin se encontra nas células?

43 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Animais modelos Cérebro (Substância negra) Tampão hipotônico e homogenizadores para tecidos moles Onde parkin se encontra nas células? Qual sua função?

44 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Animais modelos Cérebro (Substância negra) Tampão hipotônico e homogenizadores para tecidos moles Componente do proteassomo degradação de proteínas

45 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Centrifugação diferencial?

46 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Citoplasmática, em sua maioria Gel filtração? Separação por tamanho?

47 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Citoplasmática, em sua maioria ~52 KDa média proteínas: 53 KDa Cromatografia de troca iônica?

48 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Citoplasmática, em sua maioria ~52 KDa média proteínas: 53 KDa pi = ~6.9 Cromatografia de afinidade?

49 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Citoplasmática, em sua maioria ~52 KDa média proteínas: 53 KDa pi = ~6.9 E3 ubiquitina ligases se ligam a Lys Troca iônica? Uma ou duas colunas?

50 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. Citoplasmática, em sua maioria ~52 KDa média proteínas: 53 KDa pi = ~6.9 E3 ubiquitina ligases se ligam a Lys Duas colunas aniônicas: forte e fraca

51 Exercícios Situação hipotética: Você escolheu como projeto de IC estudar as propriedades bioquímicas da proteína Parkin. Mutações no gene parkin estão associadas a casos hereditários de Parkinsonismo em humanos. Descreva uma estratégia para purificar Parkin nativa. E isso tudo será que é suficiente?

52 Exercícios Situação hipotética: Considerando que a purificação da Parkin nativa tem se mostrado extremamente trabalhosa, monte uma estratégia para expressar e purificar uma versão recombinante da Parkin humana. Para casa...

53 Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas Curso de Ciências Biológicas 1º Semestre de 2015 Próximas aulas: Sexta 22/05 Proteômica Sábado 23/05 Prática SDS-PAGE

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