CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA DREPANOCITOSE (Anemia Falciforme)

Transcrição

1 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DA DREPANOCITOSE (Anemia Falciforme) Genética Humana, LCS 3º Ano,1º Semestre, ª Aula

2 Sumário Quantificação de DNA cromossomal e avaliação do grau de pureza por espectrofotometria Avaliação da integridade por electroforese em gel de agarose Amplificação por PCR da região genómica de interesse

3 Espectofotometria A concentração de RNA ou DNA pode ser medida directamente por espectofotometria na região do ultra-violeta. Os ácidos nucleicos absorvem a luz UV de uma forma eficiente permitindo a sua detecção a concentrações baixas: 2,5 ng/µl. As bases aminadas dos nucleótidos têm uma absorvância máxima a 260 nm e o coeficiente de extinsão molar é de 20, para uma distância de 1cm. Uma solução de DNA em dupla cadeia a uma concentração de 50µg/ml terá uma absorvância de 1 a 260nm. Uma solução de RNA em cadeia simples a uma concentração de 40µg/ml terá uma absorvância de 1 a 260nm.

4 Concentração Ác. Nucleicos Concentração de DNA (µg/ml): (Abs 260nm) x (factor de diluição) x (50 µg DNA/ml) / (1unidade Abs 260nm) Concentração de RNA (µg/ml): (Abs 260nm) x (factor de diluição) x (40 µg RNA/ml) / (1 unidade Abs 260nm)

5 Interferentes Fenol: tem um máximo de absorvância a 270 nm mas o seu espectro sobrepõem-se ao dos Ác. nucleicos. Contaminação com Fenol: leitura com erro por excesso. Extracção com clorofórmio. Remoção do clorofórmio: evaporação.

6 Proteínas Absorvem na zona do ultra-violeta, com um máximo a 280 nm, devido especialmente à presença de resíduos de aminoácidos aromáticos (triptofano, tirosina e fenilalanina). A absorvância de uma amostra de DNA a 280 dá uma estimativa da sua contaminação com proteínas. A razão das absorvâncias a 260nm / 280 nm é uma medida da pureza do DNA: deverá variar entre 1,65 e 1,85.

7 NanoDrop Espectofotómetro para micro volumes, 0.5 µl e cuvetes.

8 Electroforese Ác. Nucleicos Num tampão a ph alcalino, os ácidos nucleicos ficam com carga negativa (grupos fosfato e açucar) Em tampão TBE, ph=8,3, os ácidos nucleicos migram para o ânodo (vermelho +) DNA e RNA não interagem com o gel e a migração neste é inversamente proporcional ao logaritmo da sua massa molecular

9 Agar Polissacáridos extraídos de algas vermelhas dos géneros Gracilaria e Gelidium Usos múltiplos: Culinária Microbiologia Farmácia Biologia Molecular

10 Agar É uma mistura dois polissacáridos: a agarose e a agaropectina Agarose é um polimero linear de agarobiose: dissacárido de D-galactose e 3,6-anidro-L-galactopiranose Agaropectina semelhante à Agarose mas está altamente modificada com grupos acídicos como sulfato e piruvato.

11 Agarobiose D-galactose e 3,6-anidro-L-galactopiranose

12 Gel de Agarose Funde a 85ºC e gelifica a 32-40ºC.

13 Resolução Agarose

14 10 Volt /cm Poço de aplicação Amostras com Glicerol Ânodo (-) Cátodo (+) Tampões: TBE (tris borato ph 8,3) ou TAE (tris acetato, ph 8,0). A capacidade de tamponamento do TAE é menor, mas os ácidos nucleicos correm mais depressa, ficando as bandas mais bem definidas pois a difusão é menor.

15 Visualização Ác. Nucleicos Agente intercalante da dupla cadeia, o Brometo de etídio (já foi medicamento uso veterinário) Quando intercalado e irradiado com luz UV, vai fluorescer na zona do vermelho EtBr: mutagénico; cancerígeno Consegue detectar 1 ng de ác. nucleicos em geis de agarose

16 Espectro de excitação, a azul, e de emissão, a vermelho, do Brometo de etídio quando ligado ao DNA

17 Fotografia São usados marcadores de PM e concentrações conhecidas Usa-se uma máquina fotográfica, digital ou não, com um filtro vermelho Há software para tratamento da imagem, determinação do PM das bandas e concentração de DNA

18 Exemplo M M M M M Gel Agarose a 1% em TBE. Coloração com EtBr

19 Vida a 100ºC Até aos anos 60 pensava-se que a temperatura máxima suportada pelos os seres vivos era 55ºC Em 1960, com o estudo das fontes termais no Parque Nacional Yellowstone, USA, Thomas Brock e Hudson Freeze isolaram um microrganismo que vivia a 70ºC:Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus 100ºC: ºC Brock TD and Freeze H (1969). "Thermus aquaticus, a Nonsporulating Extreme Thermophile". J. Bact. 98 (1):

20 Açores - Furnas

21 Polimerases Enzimas que catalizam a polimerização do DNA Necessitam de uma cadeia molde e de uma sequência iniciadora, o primer Adicionam nucleótidos trifosfatados à extremidade 3 hidroxilada Quando encontram um erro corrigem-no

22 PCR Tecnologia que permite amplificar uma sequência de DNA milhões de vezes Desenvolvida em 1983 por Kary Mullis, que trabalhava para a Cetus (Nobel da Química 1993) Permite amplificar fragmentos de DNA com 40 kb

23 T ambiente 95-98ºC T hibridação depende composição ATCG primer T extensão depende da polimerase Repetição

24 PCR Hoje é uma técnica com multiplos usos: Sequenciação de DNA (basta um primer) Eng. Genética Mutação pontual Detecção de patologias Aplicações forenses

25 Que polimerase?

26

27 Desenho de Primers É necessário conhecer a sequência de DNA a amplificar A temperatura de hibridação pode ser calculada somando 2ºC por cada A ou T e 4ºC por cada C ou G Certas Polimerases necessitam de cálculos um pouco mais elaborados

28 Links T hibridação