Biologia Celular e Molecular

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1 DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA Biologia Celular e Molecular Detecção de proteínas por western-blotting

2 Na electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), as proteínas migram através dos poros do gel de poliacrilamida em resposta a um campo eléctrico. O tratamento com SDS confere a todas as proteínas carga negativa, e igual densidade de carga. Assim, as proteínas aplicadas no gel migram através da matriz do gel na direcção do ânodo (polo positivo). Proteínas de menor massa molecular migram mais facilmente através da rede formada pela poliacrilamida, e, por essa razão, têm maior mobilidade do que proteínas de maior massa molecular. A separação de proteínas num gel de poliacrilamida em condições desnaturantes acontece com base na massa molecular das proteínas. O tamanho dos poros do gel diminui para concentrações crescentes de acrilamida. Geis de 15% de acrilamida utilizam-se para separar proteínas de massa molecular baixa, geis de menor concentração de acrilamida, até 7.5%, utilizam-se para separar proteínas de alta massa molecular. Depois de separadas num gel de poliacrilamida, as proteínas podem ser visualizadas por coloração do gel com uma solução de Coomassie azul. A coloração das proteínas separadas por SDS-PAGE permite obter informação sobre o tamanho da proteína recombinante produzida e purificada, e saber se essa proteína está pura. No entanto, não é possível assegurar que se trata de facto da proteína pretendida. A caracterização da proteína purificada por Western blot, utilizando um anticorpo específico, permite identificar conclusivamente a proteína purificada. 1

3 Visualização num gel de poliacrilamida, em condições desnaturantes (SDS-PAGE), das amostras recolhidas ao longo da expressão e purificação da proteína de fusão Preparação do gel de poliacrilamida Soluções: 1.5 M Tris, ph M Tris, ph % acrilamida (29 acrilamida: 1 bisacrilamida) ATENÇÃO! NEUROTÓXICO! 20% (p/v) SDS 10% (p/v) persulfato de amónio (AMPS) TEMED (Tetra-metil-etilenodiamina) Tampão de electroforese: 100 mm Tris: 100 mm Glicina, 0.1% SDS Tampão de desnaturação das amostras (2, 100 ml, ph 6.8): 1 10 ml β-mercaptoetanol 5% 4 g SDS 2% 25 ml 1M Tris, ph mm 20 ml glicerol 10% H 2 O até 100 ml Gel de separação (12% de acrilamida, 10 ml): concentração final 2.65 ml H 2 O 3.35 ml 1.5 M Tris, ph M 4 ml 30% acrilamida 12% 100 µl 20% SDS 0.2% 100 µl 10% AMPS agitar 25 µl TEMED agitar e verter imediatamente no sistema de montagem do gel, até cerca de 2cm do topo do vidro mais pequeno; adicionar uma camada de isopropanol 50%. Gel de concentração (4% de acrilamida, 5 ml): concentração final 3.1 ml H 2 O 1.25 ml 0.625M Tris, ph M 0.65 ml 30% acrilamida 4% 50 µl 20% SDS 50 µl 10% AMPS agitar 12.5 µl TEMED agitar e verter sobre o gel de separação, até ao topo do vidro mais pequeno; aplicar o pente. Solução corante (Coomassie): 0.25% Coomassie 50% metanol 10% ácido acético Solução descorante: 25% metanol 5% ácido acético 2

4 Preparação das amostras e electroforese 1. Diluir as amostras com solução desnaturante 2, na proporção 1 solução desnaturante (2 ): 1 de amostra; ferver as amostras durante cerca de 5 min 2. Aplicar as amostras no gel; aplicar também padrão de massas moleculares contento proteínas de massa molecular conhecida. Encher a tina de electroforese com tampão de electroforese e correr a electroforese a 200 V durante cerca de 45 min. 3. Corar o gel por agitação durante cerca de 15 min em solução corante e lavagem por diversas vezes em solução descorante. Nota: No caso de o gel se destinar a electrotransferência, não deve ser corado com Coomassie, mas sim directamente usado para a electrotransferência. Electrotransferência das proteínas do gel de poliacrilamida para uma membrana de PVDF e imunodetecção (Western Blot) Electrotransferência para membrana de PVDF Tampão de transferência (2l): 3 g Tris 25 mm 14.4 g glicina 192 mm 400 ml metanol 20% TBS (ph 7.6, 10, 1l): 24.2 g Tris 80 g NaCl TBST: TBS + 0.1% Tween concentração final: 1. Mergulhar a membrana de PVDF, do tamanho do gel de poliacrilamida a transferir, em metanol durante alguns segundos; de seguida, equilibrar a membrana de PVDF em tampão de transferência; 2. Incubar o gel, depois de terminada a electroforese, em tampão de transferência; 3. Montar a cassete de transferência, de acordo com o esquema da figura 2; 4. Inserir a cassete na tina de transferência, tendo em conta que a membrana de PVDF deve ficar do lado no ânodo (polo positivo); 5. Transferir durante a noite, a 25 V, à temperatura ambiente; 6. Após a transferência, fixar a membrana em 25% de metanol, 5% de ácido acético; membra Papel de filtro Esponja Gel Fig. 1. Esquema de montagem da cassete de electrotransferência. 3

5 Imunodetecção 1. Bloquear a membrana durante 1 h, em 0.5% de leite magro em TBST; 2. Incubar a membrana com o anticorpo primário, diluído em 0.5% de leite magro em TBST, durante 1h, à temperatura ambiente; 3. Lavar a membrana 5 vezes, 5 minutos cada vez, com 0.5% de leite magro em TBST; 4. Incubar a membrana com o anticorpo secundário, conjugado com a fosfatase alcalina, diluído em 0.5% de leite magro em TBST, durante 1h, à temperatura ambiente; 5. Lavar a membrana 5 vezes, 5 minutos cada vez, com 0.5% de leite magro em TBST; 6. Revelar a membrana pelo método ECF ou usando um substrato cromogénico da fosfatase alcalina. Método ECF de revelação do imunoblot Para revelação do imunoblot pelo método ECF (Enhanced ChemiFluorescence) é necessário utilizar um anticorpo secundário conjugado com a fosfatase alcalina. A fosfatase alcalina cataliza a conversão do ECF num produto que fluoresce a nm. 1. Calcular o volume de substrato para a fosfatase alcalina (ECF) a utilizar, de modo a usar 24 µl/cm 2 de membrana; 2. Colocar a membrana, depois de lavado o excesso de anticorpo secundário, sobre um quadrado de plástico limpo, numa superfície lisa, colocando para cima o lado da membrana que esteve em contacto com o gel de poliacrilamida; 3. Pipetar o volume de ECF necessário e colocar no topo da membrana; incubar durante 3 minutos; 4. Remover o excesso de ECF e visualizar a marcação na membrana num detector de fluorescência. Revelação do imunoblot usando um substrato cromogénico Adicionar o substrato da fosfatase alcalina [5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato (BCIP)/ Nitroblue Tetrazolium (NBT)] à membrana; incubar até aparecimento de cor violeta. 4

6 IMUNOBLOT (ou Western blot) Separação das proteínas em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE) Electrotransferência para membrana de PVDF Bloqueio dos locais não específicos Incubação com o anticorpo primário; remoção do excesso de anticorpo, não ligado Incubação com o anticorpo secundário, conjugado com a fosfatase alcalina (AP); remoção do excesso de anticorpo Incubação com o substrato ECF ou com o substrato cromogénico (BCIP/NBT) Visualização da marcação fluorescente a 540 mn (ECF) ou da marcação violeta (BCIP/NBT) 5

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