Eletroforese de DNA. Gabriel M. Matos Nicolas Conceição

Transcrição

1 Eletroforese de DNA Gabriel M. Matos Nicolas Conceição

2 Eletroforese Usada para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA; Bastante sensível, capaz de detectar até 20 pg de DNA; Permite a recuperação dos fragmentos após a separação.

3 Eletroforese em gel de agarose

4 Eletroforese em gel de agarose Etapas da eletroforese 1) Preparo do Gel Agarose ou Poliacrilamida 2) Migração 3) Visualização dos fragmentos

5 Tipos de géis A escolha da matriz de separação usada depende principalmente do tamanho dos fragmentos analisados. Agarose: Separa fragmentos de tamanhos muito distantes ( pb) Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb de diferença.

6 Tipos de géis Agarose: polímero linear composto por resíduos de galactose unidos por ligações glicosídicas.

7 Tipos de géis Algas rodophytas utilizadas na extração do ágar A porcentagem utilizada é medida em peso/volume

8 Tipos de géis A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e resfriada para formação do gel (Gelificação) C C

9 Tipos de géis Concentração do gel (w/v %) Faixa de separação de DNA (kb) Sambrook et al., Molecular Cloning 3 ed % 0,3%

10 Tipos de géis

11 Tipos de tampões Solução Tampão: Manter ph estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida da molécula) Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)

12 Tipos de tampões Tris-Acetato e EDTA TAE Tris-Borato e EDTA -TBE Tris-Fosfato e EDTA - TPE Qual escolher??

13 Tipos de tampões Tris-Acetato e EDTA TAE Melhor resolução para fragmentos maiores. Tris-Borato e EDTA -TBE Tris-Fosfato e EDTA - TPE

14 Tipos de tampões Diferença entre gel feito com Tampão e Água

15 Tipos de tampões Gel-LoadingBuffer: usado para aumentar a densidade da amostra e dar cor a amostra; Azul de Bromofenol (migra mais rápido) Xileno Cianol Sacarose / Glicerol / Ficoll

16 Tipos de tampões

17 Corrida

18 Corrida Os ácidos nucleicos apresentam uma carga líquida negativa. Com aplicação de uma corrente elétrica eles migram em direção ao polo positivo Corrente elétrica

19 Corrida

20 Corrida

21 Migração Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose: Tamanho da molécula de DNA;

22 Migração Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose: Tamanho da molécula de DNA; A concentração de Agarose;

23 Poliacrilamida Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de acrilamida e bis-acrilamida. Maior poder de resolução (até 1 pb)

24 Poliacrilamida Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de acrilamida e bis-acrilamida. Dependente de radicais livres (PAS e TEMED)

25 Poliacrilamida Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de acrilamida e bis-acrilamida.

26 Visualização dos fragmentos PCR Eletroforese Visualização

27 Visualização dos fragmentos PCR Eletroforese Visualização

28 Visualização dos fragmentos Colorimétrico Fluorescência

29 Visualização dos fragmentos Corantes Nitrato de prata Alta sensibilidade

30 Visualização dos fragmentos Corantes Nitrato de prata Prata DNA Alta sensibilidade Redução da prata Cor

31 Visualização dos fragmentos Corantes Nitrato de prata Prata DNA Alta sensibilidade Redução da prata Cor

32 Visualização dos fragmentos Fluorescência

33 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA

34 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA

35 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA A T Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA C G A T

36 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA A T Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA C G A T

37 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA A T Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA C G A T

38 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA

39 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Água age como uma molécula quencher absorvendo a fluorescência. Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA

40 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA Como emitem fluorescência?

41 Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Absorvem luz em um comprimento de onda e emitem em um comprimento menor (menos energia) A C T G A T

42 Visualização dos fragmentos Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese

43 Visualização dos fragmentos Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese A T C G A T A T C G A T A T C G A T A C A A C A A C T G T T G T T G A T

44 Visualização dos fragmentos Brometo de Etídio Intercalante muito utilizado para visualização do DNA

45 Visualização dos fragmentos Brometo de Etídio Intercalante muito utilizado para visualização do DNA Excitação em luz UV Emissão em luz laranja/vermelho

46 Visualização dos fragmentos

47 Visualização dos fragmentos Brometo de Etídio Intercalante muito utilizado para visualização do DNA Pico de excitação em 285 nm (luz UV) Pico de emissão em 605 nm (luz laranja/vermelho) É considerado tóxico

48 Visualização dos fragmentos Intercalantes alternativos Blue Green SYBR Green GelRed GelGreen

49 Visualização dos fragmentos Mas isso é do tamanho esperado?

50 Visualização dos fragmentos Mas isso é do tamanho esperado?

51 Interpretação de Resultados Presença ou ausência

52 Interpretação de Resultados Presença de fragmentos de diferentes tamanhos 500 pb 300 pb

53 Interpretação de Resultados Expressão diferencial de determinado gene

54 Interpretação de Resultados Expressão diferencial de determinado gene

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