Biologia Molecular de Corinebactérias Produtoras de Aminoácidos: Análise do Genoma de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869

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1 Biologia Molecular de Corinebactérias Produtoras de Aminoácidos: Análise do Genoma de Brevibacterium lactofermentum ATCC António Carlos Matias Correia Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para obtenção do grau de Doutor Universidade de Aveiro 1995

2 ÍNDICE I. INTRODUÇÃO 1. O grupo das corinebactérias: características gerais e biologia molecular Plasmídeos endógenos e desenvolvimento de vectores Fagos Sistemas de introdução de DNA em corinebactérias Genes clonados de corinebactérias Expressão de genes heterólogos em corinebactérias Necessidade de outros tipos de abordagem Análise física e genética de pequenos genomas Aplicações da técnica de PFGE Parâmetros importantes em PFGE Análise de genomas eucariotas por PFGE Análise de genomas procariotas por PFGE Estratégias de mapeamento de pequenos genomas Busca de marcadores físicos e genéticos Outras aplicações Objectivos do presente trabalho II. MATERIAL E MÉTODOS 1. Estirpes bacterianas e plasmídeos Meios de cultura Conservação dos microorganismos Reagentes Composição de soluções de uso geral Aditivos para os meios de cultura Antibióticos Indicadores de complementação pelo gene lacz Enzimas para extracção de ácidos nucleicos Marcadores de peso molecular para DNA Marcadores de baixo peso molecular Marcadores de alto peso molecular Preparação de DNA total Preparação de DNA total em blocos de agarose Preparação de DNA total em solução Método rápido Método para DNA de alto peso molecular Preparação de plasmídeos Mini-preparação de plasmídeos de E.coli Lise alcalina Ultracentrifugação em gradiente de CsCl Ultracentrifugação em gradiente de sacarose Tratamento enzimático de DNA Hidrólise por endonucleases de restrição Digestão de DNA genómico embebido em agarose Digestões parciais de DNA total... 35

3 10.2. Ligação de fragmentos de DNA Desfosforilação de extremos de DNA 5`-livres Preenchimento de extremos de DNA 3`-recessivos Electroforese de DNA Electroforese em gel de agarose convencional Electroforese em campo eléctrico pulsado (PFGE) Visualização do DNA Determinação do tamanho de DNA em géis de agarose DNA plasmídico (CCC) Fragmentos lineares de DNA Determinação do tamanho de fragmentos separados por PFGE Purificação de fragmentos de DNA de géis de agarose Extracção por "freeze-squeeze" Método do Butanol-CTAB Quantificação de ácidos nucleicos Quantificação por espectrofotometria Quantificação por emissão de fluorescência Transferência de fragmentos de DNA separados em gel de agarose para filtros de nylon Transferência in situ de DNA de colónias Transferência directa de DNA para filtros de nylon, "dot-blot" Detecção de sequências homólogas por hibridação DNA-DNA Marcação radioactiva de sondas de DNA Hibridação Lavagem dos filtros e autorradiografia Reutilização dos filtros Introdução de DNA em E.coli Indução do estado de competência pelo método do TSS Transformação de células competentes Transformação por electroporação Empaquetamento in vitro e infecção de E.coli Empaquetamento Infecção de E.coli DH Introdução de DNA em corinebactérias Preparação das células Electroporação Sequenciação de DNA Delecções unidireccionais nos plasmídeos recombinantes Preparação de DNA monocatenário Reacções de síntese de cadeia Géis de sequenciação Métodos estatísticos Frequência de sequências reconhecidas por enzimas de restrição Determinação do coeficiente de semelhnça III. RESULTADOS Análise de genomas por PFGE: B.lactofermentum e outras corinebactérias. 1. Selecção de ERs para análise de genomas de corinebactérias por PFGE

4 2. Análise do genoma de Brevibacterium linens ERs reconhecendo sequências de 6 pares de bases ERs reconhecendo sequências de 8 pares de bases, ricas em As e Ts Tamanho do genoma Diferenciação das estirpes ATCC 9172 e ATCC com a ER DraI B.lactofermentum ATCC e estirpes relacionadas Perfis NotI de estirpes relacionadas com a estirpe ATCC Tamanhos dos genomas Ausência de elementos genómicos de topologia linear IV. RESULTADOS Construção de genotecas de DNA de B.lactofermentum. 1. Construção de uma genoteca em cosmídeos Preparação do vector Preparação do DNA genómico Obtenção de cosmídeos recombinantes Confirmação da genoteca Representatividade da genoteca Conservação da genoteca Conservação da genoteca amplificada Conservação em placas de micro-titulação Construção de genoteca em plasmídeos Características das genotecas V. RESULTADOS Clonagem de elementos repetidos no genoma - IS. 1. Hibridação subtractiva com genoteca em cosmídeos Clonagem das sequências repetidas Análise da sequência de nucleótidos do DNA repetitivo Existência de uma presumível transposase Existência de uma sequência homóloga em C.glutamicum ATCC Semelhança de RITs Número de cópias de IS13869 no genoma de B.lactofermentum ATCC e descriminação de estirpes dela derivadas por padrões de hibridação Número de cópias Descriminação de estirpes por padrões de hibridação de fragmentos SwaI e PacI separados por PFGE Descriminação de estirpes por padrões de hibridação de fragmentos de restrição separados por electroforese convencional Presença de sequências homólogas noutras estirpes de corinebactérias VI. RESULTADOS Clonagem de elementos repetidos no genoma - rdna. 1. Sonda

5 2. Hibridação com a genoteca em cosmídeos Identificação de bandas BamHI contendo DNA codificando para rdna 16S Clonagem de rdnas Presença de DNA codificando para rrna 16S Presença de DNA codificando para rrna 23S Número de cópias de rdna no genoma de B.lactofermentum VII. RESULTADOS Estratégias de mapeamento do genoma. 1. Sondas constituídas por fragmentos de genes clonados Sonda constituída pelo gene aphii (Kn R ) para estirpes modificadas por mutagénese dirigida Cosmídeos recombinantes seleccionados ao acaso usados como sondas Obtenção de clones de ligação De uma genoteca em plasmídeos Construção de cassette Kn R, com extremos PacI e SwaI Obtenção de clones de ligação De uma genoteca em cosmídeos Uso de bandas PacI como sondas sobre bandas SwaI Mapeamento de elementos repetidos: localização de cada uma das cópias de IS Construção de um vector integrativo específico para IS Introdução de pulispsp em B.lactofermentum R Caracterização dos transformantes por determinação de "impressões digitais" EcoRI Análise dos transformantes em campo eléctrico pulsado Marcadores associados às bandas PacI e SwaI que constituem o perfil de restrição do DNA de B.lactofermentum Esboço de um mapa físico e genético de B.lactofermentum VIII. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES 1. Discussão Análise dos perfis de restrição Dimensões genómicas Frequência de corte das ERs testadas Relação entre estirpes "do ácido glutâmico" ERs úteis para a construção de um mapa físico Sequências repetidas no genoma IS Genes de rrna Mapeamento do genoma Perspectivas futuras Conclusões IX. BIBLIOGRAFIA Bibliografia

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