PREPARO DE SOLUÇÕES EM BIOLOGIA MOLECULAR

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ CAMPUS DE PARNAÍBA Mestrado em Biotecnologia Semestre PREPARO DE SOLUÇÕES EM BIOLOGIA MOLECULAR DATA: AULA PRÁTICA 2: preparo de soluções em biologia molecular. I. Introdução O tópico que envolve preparo de soluções e soluções tampão em um laboratório de experimental nas áreas da saúde, de Biologia, Química e outras é de extrema importância para o bom andamento de todo o trabalho, seja este de rotina, seja de pesquisa básica/tecnológica. A falta de rigor no cálculo e no preparo de soluções leva fatalmente a resultados inesperados, imprecisos e com erros incontroláveis. O importante é ter um bom conceito do que significa molaridade, percentual, diluição sequencial, tampão, cálculos para preparar um tampão, mecanismo de funcionamento de um eletrodo, medida de ph etc. Esses conceitos encontram-se bem fundamentados em livros básicos de Bioquímica Experimental, os quais irão orientá-lo nesse tópico. De maneira resumida, pode-se conceituar: 1. Molaridade (M): expressa a concentração de uma solução em Molar. 1 Molar = 1 mol de soluto em 1 L de solução; por sua vez, 1 mol de soluto = massa molecular em gramas do soluto = Σ das massas atômicas que compões o soluto. Dessa forma, por exemplo, 1 mol de NaCl = 58,5 g, ou seja, Σ das massas atômicas dos elementos químicos Na (23 g) e Cl (35,5 g). Então para fazermos uma solução de NaCl 1M, teremos de pesar 58,5 g de NaCl, dissolvê-lo em H 2O, completando o volume final para 1 litro. Os submúltiplos desta solução (0,1 M; 5 mm etc.) poderão ser obtidos por diluição da solução 1M. 2. Percentual: outra forma de expressar a concentração de uma solução pode ser m/v, isto é, uma relação massa/volume, ou v/v, isto é, volume/volume, ou ainda, mais raramente, m/m, massa/massa Uma solução de NaCl 2% contém 2 g do soluto NaCl em 100 ml de solução (volume final). Para prepará-la, basta tomar 2 g de NaCl, dissolvê-lo em H2O e completar o volume final para 100 ml. Uma solução de glicerol 10% contém 10 ml de glicerol em 100 ml total de solução. Para prepará-la, deve-se medir com precisão 10 ml de glicerol e completar com água para um volume final de 100 ml. 3. Outras formas de expressar a concentração de uma solução: por exemplo, mg/ml, µg/ml etc. Para preparar uma solução 10 mg/ml, caso você necessite de 100 ml dessa solução, basta pesar, por exemplo, 1 g do soluto e dissolvê-lo, completando o volume final para 100 ml. Você terá 1000 mg/100 ml, que equivale dizer 10 mg/ml daquela solução. 4. Solução tampão: tampão é uma solução capaz de manter o ph de um sistema experimental praticamente constante, mesmo se pequenas quantidades de ácido ou base sejam a ele adicionadas. A escolha de um bom tampão depende dos seguintes critérios: a) do ph que se deseja manter constante. Para isso, deverá ser escolhido um sistema ácido/base conjugado com pka (da base ou do ácido) o mais próximo posível do ph desejado. O pka é o ponto de inflexão da curva 1

2 de neutralização de um grupamento ácido ou básico. Assim, a capacidade tamponante será maior em um ph próximo ao pka, pois nessa faixa é mais fácil absorver radicais OH - e H + gerados nessa solução; b) da capacidade tamponante do par ácido/base (permite o preparo de soluções tampão de menor concentração); c) da possibilidade de não alterar fortemente outras variáveis do sistema, como, por exemplo, a força iônica, fator importante nos sistemas biológicos. II. Material utilizado no preparo de soluções Balança analítica Balança comum Espátula phmetro soluções-padrão para calibração de ph agitador magnético barra magnética ( pulga, bailarina ) capela de exaustão béqueres erlenmeyers provetas bastão de vidro III. Cuidados importantes O preparo de soluções com rigor passa pela avaliação do reagente químico que será utilizado. O acondicionamento adequado dos reagentes é um fator importante no preparo correto de soluções. Aspectos como higroscopia, volatilidade, dentre outros, devem ser adequadamente monitorados. Os estoques de sais higroscópicos, ou seja, aqueles com capacidade de absorver umidade do ambiente, devem ser mantidos em condições que desfavoreçam a hidratação, como, por exemplo, em dessecador na presença de sílica. Da mesma forma, reagentes voláteis devem ser preservados em embalagens bem fechadas para minimizar a evaporação, evitando assim, alterar as concentrações originais. Aconselha-se o uso frequente do Index Merck, que apresenta as características principais para a maioria dos reagentes de uso comum em laboratórios até mesmo tratando dos cuidados com a segurança que se deve tomar na manipulação bem como as características físico-químicas de um dado reagente. Importantes também são a conservação e a manutenção dos equipamentos básicos e necessários para o preparo de soluções, como as balanças e o phmetro. Em geral, esses equipamentos servem para um laboratório todo, com muitos pesquisadores ou outros profissionais trabalhando em conjunto. As balanças devem ser rotineiramente verificadas com peso-padrão para avaliar a sua exatidão e precisão. Não se devem deixar espalhar reagentes corrosivos (ácidos fortes, bases fortes, solventes orgânicos) no interior e no prato de uma balança de precisão, pois podem provocar corrosão, o que inviabiliza o uso da balança. Para isso, cuidados com a limpeza pós-uso devem ser redobrados. A escolha de uma balança de alta ou baixa sensibilidade (peso maior ou menos) deverá ser feita baseada na quantidade do reagente que você necessita para preparar a solução. Se você necessita de pequenas massas do soluto, deverá escolher uma balança de maior precisão (menor erro), e, em situação de altas massas do soluto, a sua pesagem poderá ser feita em balanças de menor precisão, pois o seu erro não será significativo. Cuidados necessários devem ser tomados no momento da dissolução do soluto em H 2O ou em outro solvente pertinente, para que o volume final não ultrapasse aquele requerido, de forma a não alterar a concentração final da solução. Aconselha-se dissolver o soluto em pequenos volumes do solvente para depois ajustar o volume final àquele calculado previamente. O phmetro é outro equipamento de fundamental importância no preparo das soluções tampão e daquelas que necessitam de ajuste de ph para dissolução de solutos (exemplo: EDTA em H 2O e outras). O ajuste de ph deverá ser feito após calibração do phmetro com soluções padrão de ph previamente conhecidas. É necessário calibrar a faixa de leitura de ph para que o ajuste da solução em preparo seja corretamente feito. O eletrodo, sensor da concentração de íons Hidrogênio (H + ), deve ser cuidadosamente mantido em um laboratório experimental. A sua limpeza exaustiva com H2O destilada, após utilização, é necessária para o bom funcionamento do eletrodo. 2

3 IV. Soluções para preparo Material necessário: reagentes equipamentos vidraria/outros soluções para calibração de ph Balança comum Espátula Tris base phmetro Barra magnética (pulga) HCl agitador magnético béqueres EDTA erlenmeyers NaOH provetas Ácido bórico bastão de vidro sacarose frascos vidro 1 L com tampa azul de bromofenol frascos vidro 100 ml com tampa brometo de etídeo tubos falcon 50 ml com tampa DNA ladder microtubos de 1,5 ml dntps Luva descartável ologonucleotídeos (primers) H2O destilada e Milli-Q TRIS-HCL 1M ph 8.0 (solução estoque) - Tris base 121,1 g - H 2O milliq 800 ml - HCl 42 ml deixar descansar durante a noite, verificar ph no dia seguinte (autoclavar; guardar em temperatura ambiente). EDTA 0,5M ph 8.0 (solução estoque) Solução I: - EDTA 181,1 g - H 2O milliq 800 ml Solução II: - NaOH 20 g - H 2O 200 ml Deixar descansar durante a noite; no dia seguinte misturar as soluções e medir ph (autoclavar; guardar em temperatura ambiente). T.E. 1X (10:1) ml - Tris-HCl 1M ph ml - EDTA 0,5M ph 8.0 0,2 ml autoclavar; guardar em temperatura ambiente. Tampão TBE 10X (solução estoque) - tampão de gel e corrida/ eletroforese - Ácido Bórico 55 g - Tris base 108 g - EDTA (0,5M) 8,3 g - completar p/ 1 L com água destilada Pesar os reagentes, colocar 400 ml de água destilada e deixar no agitador magnético até a solução ficar transparente (dissolver todos os reagentes). Completar para 1 L com água destilada. Autoclavar; guardar em temperatura ambiente. 3

4 Tampão de amostra de DNA 100 ml (DNA loading blue buffer) - 40% Sacarose 40 g - glicerol 50 ml - 0,25% Azul de bromofenol (AB) 0,25 g - 0,25% AB 0,25 g Brometo de etídeo (10 mg/ml) 100 ml (colocar no gel agarose) Permitirá visualizar a corrida das amostras no gel e que a amostra fique (pese) no pocinho e não se misture ao tampão de corrida (eletroforese). Distribuir em eppendorfs de 1,5 ml e congelar. - Brometo de etídeo 1 g - H 2O destilada 50 ml Corante fluorescente (e mutagênico) que se intercala entre as bases da cadeia dupla do DNA. Quando irradiado com luz UV, este emite fluorescência permitindo a visualização do DNA no gel. Padrão de pesos moleculares (DNA Ladder) 100 pb ou 50 pb - T.E. 1X 216 µl - H 2O de ampola estéril: 256 µl - Tampão de amostra 40 µl - DNA ladder: 24 µl - DNA ladder 24 µl Permitirá fazer uma estimativa da dimensão (pares de bases pb) de cada fragmento de DNA das amostras. Congelar. dntps 100 mm (desoxirribonucleotídeos trifosfatados) - datps 10 µl - dttps 10 µl - dctps 10 µl - dgtps 10 µl - H 2O Milli-Q autoclavada 460 µl solução de 2mM ou 200 µm Oligonucleotídeos ou iniciadores sintéticos (primers) Opção 1 para diluição de uso do primer para PCR: - Primeiro fazer uma diluição estoque do oligonucleotídeo sintético liofilizado adicionando µl de H 2O estéril (ampola de H 2O para injeção). Deixar na geladeira por um dia. - No outro dia, preparar a diluição de uso para uma concentração de 100 ng/µl considerando: as informações sobre o oligonucleotídeo sintético contidas no papel fornecido pelo laboratório fabricante, como µg ou mg. - usar a fórmula, onde: C1 = valor da solução mãe (diluição estoque) (µg ou mg da informação nas especificações do oligonucleotídeo # ) V1 =? (volume a determinar que deve ser retirado da diluição estoque) C2 = 100 ng/ µl (concentração de uso do oligonucleotídeo para PCR) V2 = 100 µl (volume final da diluição de uso para PCR; é variável) - # Com a adição de µl de H 2O para a diluição estoque do oligonucleotídeo liofilizado, a informação em µg passa para ng, padronizando as medidas em C1 e C2. Exemplo: 0,24 mg = 240 µg passa para 240 ng. (1 µg = ng) - completar p/ 100 µl a diluição de uso com H 2O de ampola estéril. Primer a Primer b 240 ng.v1 = 100 ng/ µl.100 µl 210 ng.v1 = 100 ng/ µl.100 µl V1 = /240 V1 = /210 V1 = 42 µl da solução estoque do primer V1 = 48 µl da solução estoque do primer 58 µl H 2O de ampola estéril 52 µl H 2O de ampola estéril 100 µl solução uso (100 ng/ µl) 100 µl solução uso (100 ng/ µl) 4

5 Opção 2 para diluição de uso do primer para PCR: µmol/l nmol/ml µm pmol/µl Primer a 38.2 nmol multiplica por 10X = 382 µl adicionar 382 µl de H 2O estéril de ampola logo: 38.2 nmol/382 µl ou 38.2 nmol/0,382 ml Primer: delimita a região ou seqüência do DNA (gene) que pretende amplificar por PCR. Diluir os primes e congelar a diluição de uso. Congelar também a solução estoque de primer nmol ,382 ml X ml X = 100 µm ou 100 pmoles/µl (solução estoque de primer) Concentração recomendada do primer em uma reação de PCR de 25 µl: 0,1 0,5 µm Primer solução uso 100 µm.v1 = 10 µm.100 µl 1 µl = 10 µm V1 = 1.000/100 reação PCR = 25 µl V1 = 10 µl solução estoque primer 90 µl H 2O estéril 10 µm.1 µl = C2.25 µl 100 µl solução de uso (10 µm/µl) C2 = 10/25 C2 = 0,4 µm (micromolar) Diluição da solução de uso do primer a: 10 µl da solução estoque de primer + 90 µl de H 2O estéril. Colocar 1 µl desta solução de uso do primer em cada reação de PCR de 25 µl (0,4 µm de primer). Primer b Mesmo raciocínio do primer a, mas na concentração de 32.7 nmol. Multiplica por 10X, assim adiciona 327 µl de H 2O estéril de ampola concentração de 100 µm (solução estoque de primer). Diluição da solução de uso do primer b: 10 µl da solução estoque de primer + 90 µl de H 2O estéril. Colocar 1 µl desta solução de uso do primer em cada reação de PCR de 25 µl (0,4 µm de primer). V. Bibliografia AZEVEDO, M.O.; FELIPE, M.S.S.; BRÍGIDO, M.M.; MARANHÃO, A.Q.; DE-SOUZA, M.T. Técnicas básicas em Biologia Molecular. Brasília: UNB, SAMBROOK, J.; RUSSEL, D.W.. Molecular Cloning a laboratory manual. 3 rd ed. Cold Spring Harbor, Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,