Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos por espectrometria

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1 Página 1 de 7 1 Escopo Este método tem por objetivo quantificar amido em produtos cárneos por espectrometria molecular no. 2 Fundamentos Baseia-se na determinação espectrofotométrica a 620 nm do composto colorido formado pela reação entre a antrona e a glicose proveniente da hidrólise do amido. 3 Reagentes, padrões e materiais Todos os reagentes são de grau analítico (p.a.), exceto quando especificado. Toda a água utilizada nos procedimentos é destilada/deionizada, exceto quando especificada. 3.1 Reagentes Ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ); Álcool etílico (C 2 H 5 OH); Antrona (C 14 H 10 O); Éter etílico ((C 2 H 5 ) 2 O). 3.2 Padrões D-glicose (C 6 H 12 O 6 ) (material de referência). 3.2 Materiais Balão volumétrico de 500 ml; Cubeta de vidro de 1 cm de largura; Funil de vidro; Pipetas automática de 5 ml; Pipetas volumétricas de 1, 2 e 10 ml; Proveta; Tubo de centrífuga de 25 ml; Tubo de ensaio.

2 Página 2 de 7 4 Equipamentos Balança analítica; Banho-maria; Centrífuga; Espectrofotômetro; Estufa; Placa aquecedora. 5 Precauções analíticas Este método emprega substâncias químicas nocivas e possui procedimentos que podem representar risco ao operador. Equipamentos de proteção individual e uniforme apropriado devem ser utilizados durante todo o processo. Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco biológico, evitando-se o contato direto com pele e mucosas. A lavagem com álcool etílico dos frascos de vidro e instrumentos a serem postos em contato com o reagente antrona é essencial, visto que a poeira e as sujidades reagem com ela, produzindo resultados errôneos. O tempo de 10 minutos da reação no banho-maria, descrita no item 6.0, deve ser respeitado à risca, usando em seguida um banho de gelo para cessar a reação. 6 Procedimentos Todas as operações são devidamente registradas no formulário Dados brutos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos (Anexo A). 6.1 Preparo de soluções e reagentes Solução de álcool etílico a 80% (v/v) Transferir 80 ml utilizando uma proveta 100 ml para balão volumétrico de 100 ml. Completar volume com água e homogeneizar. Essa solução tem prazo de validade indeterminado.

3 Página 3 de Solução de ácido sulfúrico a 0,5 N Pipetar 15 ml de ácido sulfúrico utilizando pipeta volumétrica e transferir para um balão volumétrico de 1000 ml já contendo aproximadamente 100 ml de água. Completar o volume com água e homogeneizar. Armazenar em frasco âmbar. Essa solução tem prazo de validade de um ano Solução de ácido sulfúrico a 70% (v/v) Limpar toda vidraria que utilizar para o preparo da solução com álcool etílico. Secar a vidraria. Adicionar 240 ml de água deionizada no balão volumétrico de 1000 ml, acondicionando este balão em um banho de gelo. Adicionar lentamente com auxílio de uma proveta 700 ml de ácido sulfúrico p.a. Esfriar e avolumar o balão. Armazenar em frasco âmbar. Essa solução tem prazo de validade de um ano Solução de antrona a 0,1% (m/v) Limpar toda vidraria que utilizar para o preparo da solução com álcool etílico. Pesar 0,10 g de antrona em béquer de 100 ml. Macerar os cristais com um bastão de vidro. Adicionar pequenas porções da solução de ácido sulfúrico 70%, devidamente fria, e com o auxílio de um bastão de vidro dissolver completamente a antrona. Transferir o conteúdo do béquer para o balão volumétrico de 100 ml completando o volume com a solução de ácido sulfúrico 70%. Esta solução deve ser preparada e utilizada no dia da análise, ou seja, não deve ser estocada. Sua coloração é amarelada e seu complexo com glicose é de cor esverdeada Solução padrão estoque de D-glicose a 1% (m/v) Pesar 1 g de D-glicose (seco em estufa a 70 C por 1 hora) em um béquer de 100 ml, dissolver com a ajuda de um bastão de vidro utilizando água. Transferir quantitativamente todo conteúdo para um balão volumétrico de 100 ml. Esta solução deve ser preparada e utilizada no dia da análise, ou seja, não deve ser estocada Solução padrão de trabalho de D-glicose a 0,01% (m/v) Pipetar 1 ml da solução padrão estoque de D-glicose para uma balão volumétrico de 100 ml, completando com água.

4 Página 4 de 7 Esta solução deve ser preparada e utilizada no dia da análise, ou seja, não deve ser estocada. 6.2 Determinação do amido Viabilização do analito Pesar com exatidão 0,5 g de amostra, perfeitamente homogeneizada, diretamente para tubo de centrífuga e lavar com três porções sucessivas de 5 ml de éter etílico seguidas de duas porções sucessivas de 5 ml de solução a 80% (v/v) de álcool etílico à quente. Após a adição de cada alíquota de solvente, agitar bem o tubo e centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm. Após as lavagens, secar o resíduo em estufa a 105ºC por uma hora, ou em banho de água fervente Hidrólise ácida Adicionar 10 ml da solução de ácido sulfúrico 0,5 N e colocar o tubo em banho-maria tendo o cuidado de manter o nível da solução contida no tubo abaixo do nível do banho. Aquecer durante uma hora mantendo o nível da água do banho na posição original, agitando o conteúdo do tubo ocasionalmente Preparo de solução-estoque Decorrido o tempo estabelecido no tem 6.2.2, transferir quantitativamente o conteúdo do tubo para balão volumétrico de 500 ml e completar o volume com água. Homogeneizar e decantar por aproximadamente uma hora Complexação Pipetar 2 ml desta solução para um tubo de ensaio previamente lavado com álcool etílico. Adicionar 10 ml da solução de antrona agitando o tubo e utilizando um banho de gelo. Levar para banho-maria por 10 minutos sob ebulição. Retirar do banho e esfriar imediatamente submetendo a banho de gelo. Ler a cor desenvolvida em espectrofotômetro a 620 nm em temperatura ambiente. 6.3 Curva analítica Pipetar alíquotas de 0,5; 1,0; 1,5; 2 ml da solução de D-glicose a 0,01% para tubo de ensaio e adicionar água, de modo que todos eles venham a conter volume final de 2 ml. Adicionar 10 ml da solução de antrona agitando o tubo e utilizando um banho de gelo. Em seguida, colocar

5 Página 5 de 7 exatamente por 10 minutos em um banho-maria sob ebulição. Esfriar imediatamente submetendo a um banho de gelo. Ler as absorbâncias a 620 nm contra um branco preparado de modo similar ao descrito, usando água em substituição ao padrão. Construir uma curva de calibração, lançando no eixo das ordenadas os valores de absorbância e no eixo das abscissas as concentrações finais de glicose em 0, 50, 100, 150 e 200 µg de glicose/2 ml. 7 Resultados Os resultados são aceitos se observadas as precauções analíticas e se realizados todos os procedimentos em conformidade com este método. Em caso de quebra de balões volumétricos ou perda de amostra, os resultados são desconsiderados e o ensaio deve ser repetido. Realizar o ensaio em duplicata. 7.1 Cálculos e expressão dos resultados Os cálculos devem ser realizados na planilha eletrônica Cálculos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos (Anexo B). O resultado é a média das duplicatas Cálculo do amido em porcentagem: Onde: 0,9 = fator de conversão da glicose em amido; A = absorbância; a = coeficiente linear da reta; Al = alíquota de amostra utilizada (ml); b = coeficiente angular da reta; D = volume estoque do balão utilizado (ml); L = valor de amido em (µg/2ml); m = massa da amostra em microgramas.

6 Página 6 de Validação da planilha A planilha Cálculos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos deve ser validada quinzenalmente, através de cálculos manuais que devem ser registrados no formulário Validação da planilha de cálculos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos (Anexo C). 8 Arquivamento dos registros O formulário Dados brutos - Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos deve ser arquivado na pasta Dados brutos. A planilha Cálculos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos deve ser mantida protegida na pasta eletrônica Resultados. O formulário Validação da planilha de cálculos deve ser arquivado na pasta Validação da planilha de cálculos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos. 9 Referências BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Instrução Normativa nº. 20, de 21 de julho de Métodos analíticos físico-químicos para controle de produtos cárneos e seus ingredientes, sal e salmoura. Diário Oficial da União de 27/07/1999, Brasília, DF. 10 Anexos Anexo A MET POA/SLAV/49/02 Formulário Dados Brutos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos. Anexo B MET POA/SLAV/49/02 Planilha Cálculos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos. Anexo C MET POA/SLAV/49/02 Formulário Validação da Planilha de Cálculos Determinação quantitativa de amido em produtos cárneos. 11 Alterações Item 6.1: Incluído Solução de ácido sulfúrico a 70% (v/v). Item 6.1.5: Incluído seco em estufa a 70 C por 1 hora.

7 Página 7 de 7 Item 6.2: Dividido em subitens. Incluído agitando o tubo e utilizando um banho de gelo, sob ebulição, em temperatura ambiente e por aproximadamente uma hora e agitando o tubo e utilizando um banho de gelo. Item 6.3: Excluído o ponto 0,75 ml de glicose que corresponde a 75 (µg/2ml) na curva de calibração. Item 7.1.1: Excluído FC. Incluído a, b Al, L, A, D Item 7.1.2: Excluído. 12 Responsabilidades O Responsável pelo POA/SLAV deve garantir a elaboração, aprovação, emissão, distribuição de cópias, capacitação de analistas, implementação, treinamento do pessoal para utilização, gerenciamento de não conformidades, análise crítica e revisão deste MET. A UGQ é responsável pela verificação deste MET. Elaboração/Revisão: Aprovação: Verificação: Luciano Molognoni POA/SLAV Heitor Daguer POA/SLAV Angélica Polenz Wielewicki UGQ Data: 07/02/2014 Data: 12/02/2014 Data: 20/02/2014

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