Géis de Entrada e Separação

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1 (1) Géis de Entrada e Separação ESCOLHA DO GEL Depende do tamanho da proteína que se quer detectar: Tamanho da Proteína Gel 4 40 kda 20% kda 15% kda 12% kda 10% kda 8% PREPARO DO GEL Monte a placa (gel caster+porcelana+espaçador+vidro) Encha o espaço com água, veja se há vazamento (espere 5 min); Verta a água, seque com papel filtro; Pipete o gel de separação; Pipete butanol sobre o gel; Espere o gel polimerizar; Verta o butanol; Pipete o gel de entrada sobre o gel polimerizado e coloque o pente (15 poços); Aguarde polimerizar; Pronto para uso! SOLUÇÕES Tampão Gel de Separação (p/ 200 ml) Tris 1,5M... 36,33 g SDS 0,4%... 8,0 ml SDS 10% (adicionar após o ajuste de ph) Obs.: ajustar o ph para 8.8 com HCl

2 (2) Tampão de Gel de Entrada (p/ 100 ml) Tris 0,5M... 6,05 g SDS 0,4 %... 4,0 ml SDS 10% (adicionar após o ajuste de ph) Obs.: ajustar o ph para 6.8 com HCl Acrilamida 30% (100 ml) Acrilamida g Bis-Acrilamida 1,6 % (100 ml) Bis-Acrilamida... 1,6 g SDS 10% (100 ml) SDS... 10,0 g Manter em temperatura ambiente APS 10% (1 ml) APS.... 0,1 g H2O destilada... 1 ml Estável por uma semana!

3 (3) GEL DE ENTRADA 1 gel 2 géis 4 géis Tampão gel de entrada 470 µl 940 μl 1,88 ml Acrilamida 30% 795 µl 1,59 ml 3,18 ml Bis-Acrilamida 1,6% 140 µl 280 μl 560 µl H2O destilada 985 µl 1,97 ml 3,94 ml APS 10% 6,25 µl 12,5 μl 25 µl TEMED 1,9 µl 3,75 μl 7,5 µl Obs.: Pipetar o APS e o Temed apenas na hora que for colocar o gel na placa, para que o gel não polimerize antes do tempo. SOLUÇÕES TBS (2litros) Tris 20mM... 4,84 g NaCl 0.5M...58,44 g Ajustar para ph 7.5 com HCl, Usá-lo na capela. H20 destilada q.s.p. T-TBS Diluir: TBS 1 litro Tween 500µl

4 (4) 1 gel GEL DE SEPARAÇÃO 6% 8% 10% 12% 15% Tampão gel de separação 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml Acrilamida 30% 1,60 ml 2,12 ml 2,65 ml 3,18 ml 3,98 ml Bis-Acrilamida 1,6% 0,78 ml 1,06 ml 1,33 ml 1,59 ml 1,99 ml H2O destilada 3,62 ml 2,82 ml 2,03 ml 1,23 ml 30 μl APS 10% 50 µl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl TEMED 5 µl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 2 géis 6% 8% 10% 12% 15% Tampão gel de separação 4,0 ml 4,0 ml 4,0 ml 4,0 ml 4,0 ml Acrilamida 30% 3,2 ml 4,24 ml 5,30 ml 6,36 ml 7,96 ml Bis-Acrilamida 1,6% 1,56 ml 2,12 ml 2,66 ml 3,18 ml 3,98 ml H2O destilada 7,24 ml 5,64 ml 4,06 ml 2,46 ml 60 µl APS 10% 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl TEMED 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 4 géis 6% 8% 10% 12% 15% Tampão gel de separação 8,0 ml 8,0 ml 8,0 ml 8,0 ml 8,0 ml Acrilamida 30% 6,4 ml 8,48 ml 10,6 ml 12,72 ml 15,92 ml Bis-Acrilamida 1,6% 3,12 ml 4,24 ml 5,32 ml 6,36 ml 7,96 ml H2O destilada 14,48 ml 11,28 ml 8,12 ml 4,92 ml 120 μl APS 10% 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl TEMED 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl

5 (5) SOLUÇÕES Tampão de Eletrotransferência Bio-Rad (2 litros) Tris 25 mm... 6,06 g Glicina 192 mm... 28,7 g Metanol 10% ml (40 ml Metanol PA ml H20 destilada) H20 q.s.p. Obs: É possível reutilizar uma vez o tampão! Tampão de Corrida 10X (500 ml) (Solução Estoque) Tris 0,125M... 7,57 g Glicina 1,92M... 72,1 g SDS 1% ml de SDS 10% Ajustar para ph 8.5 antes do SDS. H2O q.s.p. Tampão de Corrida 1X (250 ml) (Solução USO) Tampão 10X... 25,0 ml H2O destilada ,0 ml O volume de ml é suficiente para 1 cuba de eletroforese

6 (6) Corrida e Transferência CORRIDA - Monte o(s) gel(s) na cuba de corrida; Depois de polimerizar retire o pente; - Acrescente o tampão de corrida nos poços do gel até o limite da porcelana; - Acrescente tampão atrás da placa e na base, até o limite inferior do gel; - Pipete o padrão de peso molecular (3,5 ul) e as amostras (há 15 poços no total); - Ajuste os parâmetros da corrida: Para uma mesma fonte: 1 gel: 150V, 25 ma, ~1h 2 géis: 150 V, 50 ma, ~1h Obs.: Preste atenção na faixa azul da corrida. Quando ela chegar próxima à base do gel, pare a corrida! TRANSFERÊNCIA Membrana: Corte a membrana nas dimensões 8,5 cm x 6 cm; Corte o canto inferior direito; Lave 1 minuto em metanol; Deixe em água destilada até o final da corrida. Gel: Após a corrida, corte as bordas em excesso do gel e o canto inferior direito; Monte o sanduíche. Montagem do Sanduíche: Molhe a câmara de transferência com tampão de transferência; Monte o sanduíche: Esponja - Blot paper (novo) gel membrana Blot paper (velho) - Esponja Obs.: Ao mesmo tempo, pode ser feito a transferência de proteínas de 2 géis (1 de cada lado). Ajuste os parâmetros da transferência: 2 géis: 75V 200 ma - 2 horas

7 (7) Bloqueio e Anticorpo ETAPAS Após a Transferência...1 x 5 min T-TBS Leite Desnatado...1h (2,5 g leite em pó + 50 ml T-TBS) Obs.: Para o fígado, usar 3 g em 50 ml QUANTIDADE PARA DUAS MEMBRANAS T-TBS... 1 x 5 min Anticorpo Primário... 2 horas (pelo menos/ temp. ambiente) Anticorpo Primário... overnight 4 C no shake! Dia seguinte Ambientalizar min T-TBS... 5 x 5 min Anticorpo secundário acoplado à peroxidase... 1h T-TBS... 5 x 5 min Obs.: ml de T-TBS é suficiente para as lavagens.

8 (8) Revelação com ECL ETAPAS Prepare o ECL µl sol A + 300µl sol B Escorra o excesso de T-TBS da membrana Pipete o ECL sobre a membrana... 3 min; Não seque a membrana! Coloque no Chemidoc ligar 1 hora antes! Obs: Logo após a revelação, a membrana pode ser estripada com kit para stripping com sucesso para incubação com novo anticorpo. Stripping Assim que terminar a revelação: T-TBS... 5 min (p/ reidratar a membrana) Solução Stripping 1mL + 9mL (T-TBS) Strong - 10 min ou Mild 15 min T-TBS... 3 x 5 min Obs.: Após o stripping, reiniciar o WB a partir do bloqueio com leite. Ou, guardar a membrana em T-TBS na geladeira até o próximo dia.

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