Determinação colorimétrica de fósforo total em produtos de origem animal

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1 Página 1 de 8 1 Escopo Este método tem por objetivo determinar o teor de fósforo de produtos de origem animal. 2 Fundamentos O método se baseia na conversão do fósforo presente na amostra em ortofosfato. A reação deste com molibdato em meio ácido produz um complexo misto molibdato/fosfato que, na presença do íon vanadato, forma o ácido molibdovanadofosfórico, de cor amarelada. A intensidade da cor amarela é proporcional à concentração de íons fosfato na amostra, sendo quantificada espectrofotometricamente a 420 nm. 3 Reagentes, padrões e materiais Todos os reagentes são de grau analítico para análise (p.a.), exceto quando especificado. Toda a água utilizada nos procedimentos é destilada e deionizada, exceto quando especificada. 3.1 Reagentes Ácido clorídrico (HCl); Ácido nítrico (HNO 3 ); Ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ); Metavanadato de amônio (NH 4 VO 3 ); Molibdato de amônio ((NH 4 ) 6 MO 7 O 24.4H 2 O). 3.2 Padrões Dihidrogeno-fosfato de potássio (fosfato de potássio monobásico) (KH 2 PO 4 ) padrão primário. 3.3 Materiais Balões volumétricos de 100 ml, 200 ml, 250 ml e 1000 ml; Bastões de vidro; Beckers de 250 ml, 300 ml e 500 ml; Cadinhos de porcelana;

2 Página 2 de 8 Funis; Papel de filtro qualitativo; Pipetas graduadas; Pipetas volumétricas; Proveta. 4 Equipamentos Balança analítica, com precisão mínima de quatro casas decimais; Espectrofotômetro; Forno-mufla; Placa aquecedora. 5 Precauções analíticas Todos os procedimentos devem ser realizados com uso de equipamentos de proteção individual apropriados à utilização de equipamentos que funcionam em altas temperaturas. A coloração amarela do complexo formado possui estabilidade limitada. A leitura das amostras, após reação, deve ser feita no tempo preconizado para análise, não podendo ser protelada. Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco biológico, evitando-se o contato direto com pele e mucosas. 6 Procedimentos As operações devem ser registradas no formulário Dados brutos, anexo A do POP POA/SLAV/15 Procedimentos de rotina na análise físico-química de produtos de origem animal. Realizar o ensaio em duplicata. 6.1 Preparo das soluções Solução de vanado-molibdato de amônio Pesar 20 g de molibdato de amônio e 1 g de vanadato de amônio e transferir cada reagente para um béquer de 500 ml.

3 Página 3 de 8 Dissolver, separadamente, em 300 ml de água quente. Esfriar e filtrar se necessário. Misturar as duas soluções em um balão volumétrico de 1000 ml e adicionar 140 ml de ácido nítrico concentrado. Completar o volume com água deionizada. Transferir a solução preparada para frasco de vidro âmbar a temperatura ambiente. Rotular o frasco. A validade da solução é de no máximo cinco meses Solução-estoque de dihidrogeno-fosfato de potássio (2 mg de P/mL) Solubilizar em água deionizada exatamente 0,8788 g de fosfato de potássio monobásico previamente seco em estufa a 105ºC por duas horas, transferir para balão volumétrico de 100 ml e completar o volume com água deionizada e homogeneizar. Manter sob refrigeração Solução de trabalho de dihidrogeno-fosfato de potássio (0,1 mg de P/mL) No momento do ensaio, diluir 5 ml da solução estoque em 50 ml de água deionizada e 1 ml de ácido sulfúrico p.a., transferir para balão volumétrico de 100 ml e completar o volume com água deionizada e homogeneizar Solução de ácido clorídrico 1+3 Transferir aproximadamente 500 ml de água deionizada para o balão volumétrico de 1000 ml. Na capela de exaustão, adicionar com cuidado e lentamente, pelas paredes do balão, 250 ml de ácido clorídrico com auxilio de uma proveta. Completar o volume com água deionizada. Transferir a solução preparada para frasco de vidro âmbar rotulado. A solução deverá ser armazenada a temperatura ambiente e sua validade será de no máximo um ano. 6.2 Calcinação Pesar cerca de 3 g de amostra homogeneizada em cadinhos de porcelana identificados, previamente secos em mufla a 600 C por trinta minutos, resfriados em dessecador e tarados. Levar os cadinhos com amostras ao interior da mufla, ajustada para 200 C, até que não haja mais emissão de vapores. Aumentar gradativamente a temperatura da mufla até chegar a 600 C. Incinerar por no mínimo quatro horas, ou até que se obtenham cinzas claras. Reduzir a temperatura a cerca de 150 C, retirar os cadinhos, esfriar em dessecador por no mínimo trinta

4 Página 4 de 8 minutos e pesar. Se não se obtiver cinzas claras, adicionar 2 a 3 gotas de ácido nítrico e água destilada. Secar em estufa a aproximadamente 100 C e depois incinerar novamente. 6.3 Preparo de solução-estoque Após a retirada do forno-mufla, adicionar 15 ml de ácido clorídrico 1+3 pelas paredes dos cadinhos, para que todo o resíduo preso nas paredes desça com o ácido. Levar à ebulição branda em placa aquecedora, certificando que não haverá perda de amostra devida à forte ebulição. Retirar após 10 minutos e deixar esfriar. Filtrar para balão de 200 ml utilizando papel filtro quantitativo. Completar o volume com água deionizada, homogeneizando no final do procedimento. 6.4 Complexação Pipetar uma alíquota desta solução para balão volumétrico de 100 ml de modo que a solução final tenha não mais que 1,5 mg de P/mL. Adicionar 20 ml da solução de molibdovanadato, completar o volume com água deionizada e aguardar 10 minutos. Preparar uma prova em branco. 6.5 Colorimetria Fazer a leitura em absorbância com o comprimento de onda (λ) de 420 nm, zerando o aparelho com a prova em branco. 6.6 Curva de calibração A curva de calibração deve ser feita sempre que o ensaio for realizado. Preparar a curva de calibração a partir de alíquotas de 1, 2, 5, 7 e 10 ml da solução de trabalho de fósforo em balão volumétrico de 100 ml. Adicionar 20 ml da solução de molibdovanadato, completar o volume e homogeneizar. Essas soluções possuem estabilidade limitada, devendo ser utilizadas imediatamente e descartadas logo após o uso. Fazer a leitura no espectrofotômetro em 420 nm utilizando branco contendo 20 ml da solução de molibdovanadato e 80 ml de água deionizada. Registrar os dados no Anexo C do POP POA/SLAV/09. Obter a concentração em mg de P na alíquota a partir da curva de calibração.

5 Página 5 de 8 Calcular o coeficiente de correlação (r) e obter a equação da reta. Obter o fator de calibração (FC) a partir da razão das concentrações pelas absorbâncias dos pontos da curva. A checagem da curva de calibração é feita pela leitura da amostra de recuperação, admitindose variação de ±6% a cada análise. Quando há variação fora dessa faixa, deve-se avaliar outra amostra de recuperação. Persistindo o problema, preparar novos reagentes ou fazer outra curva de calibração. 6.7 Descarte de resíduos Os resíduos provenientes da solução padrão estoque e de trabalho poderão ser descartados na pia com água em abundância. Os resíduos da complexação com metavanadato de amônio e molibdato de amônio devem ser acondicionados em bombona apropriada, etiquetada de acordo com as normas da CIBio. 7 Resultados Em casos de funcionamento inadequado do equipamento, quebra de balões ou perda de amostra durante a realização do ensaio, os resultados são desconsiderados e o ensaio é repetido. O resultado final deve ser a média das replicatas. Os resultados são aceitos se observadas todas as precauções analíticas e se realizados todos os procedimentos em conformidade com este método. O coeficiente de correlação (r) da curva de calibração deve ser 0,95; caso contrário, a curva deve ser repetida. 7.1 Cálculos e expressão dos resultados Os cálculos são feitos na planilha, Cálculos Determinação colorimétrica de fósforo total em produtos de origem animal (Anexo A) de acordo com as fórmulas abaixo: Cálculo do teor de fósforo total (mg/100 g): Onde: W = mg de fósforo na alíquota, obtido através da curva de calibração; V = volume da solução estoque, em ml;

6 Página 6 de 8 Va = volume da alíquota, em ml; m = massa da amostra, em mg Cálculo do teor de fosfato (P 2 O 5 ): Onde: % P = fósforo total (mg/100 g); 2,29 = fator de conversão para P 2 O Validação da planilha A planilha Cálculos Determinação colorimétrica de fósforo total em produtos de origem animal (Anexo A) deve ser validada conforme descrito no POP POA/SLAV/15, através de cálculos manuais os quais devem ser registrados no formulário Validação de planilhas eletrônicas, Anexo M do POP POA/SLAV/15. 8 Arquivamento dos registros A planilha de cálculos deve ser mantida protegida na pasta eletrônica Resultados. O formulário de validação da planilha de cálculos deve ser deve ser arquivado conforme descrito no POP POA/SLAV/15 e o formulário referente à curva de calibração desse ser arquivado de acordo com o POP POA/SLAV/09. 9 Referências AOAC International. Official Methods of Analysis of AOAC International, Official Method ed. Gaithersburg: BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instrução Normativa n 25, de 2 de junho de Métodos analíticos físicoquímicos para controle de pescado e seus derivados. Brasília: Diário Oficial da União, 03/06/2011.

7 Página 7 de 8 10 Anexos Anexo A MET POA/SLAV/31/02 Planilha Cálculos Determinação colorimétrica de fósforo total em produtos de origem animal. 11 Alterações Item 6.1.2: excluído 8,788g, incluído 0,8788 g. Substituído balão volumétrico de 1000 ml por 100 ml; Item 6.1.3: Diluição da solução estoque reduzida em dez vezes; Item 6: incluído As operações devem ser registradas no formulário Dados brutos, anexo A do POP POA/SLAV/15 - Procedimentos de rotina na análise físico-química de produtos de origem animal. e Realizar o ensaio em duplicata. ; Item 6.2: excluído Registrar os dados no formulário Dados brutos Determinação colorimétrica de fósforo total em produtos de origem animal (Anexo A) ; Item 7.1: substituído Anexo B por Anexo A, excluído Os resultados são transcritos e armazenados no Anexo A. ; Item 7.2: substituído Anexo B por Anexo A, excluído quinzenalmente, através de cálculos manuais que devem ser registrados no formulário Validação da Planilha de Cálculos (Anexo C).. Incluído processo de validação de planilha de cálculos de acordo com o POP POA/SLAV/15; Item 8: excluído Os Anexos A e B devem ser arquivados juntos na pasta Dados Brutos do POA/SLAV, utilizando o número de registro em ordem crescente de cada ano. O Anexo C deve ser arquivado na pasta Validação da Planilha de Cálculos Determinação colorimétrica de fósforo total em produtos de origem animal do POA/SLAV.. Incluído A planilha de cálculos deve ser mantida protegida na pasta eletrônica Resultados. O formulário de validação da planilha de cálculos deve ser deve ser arquivado conforme descrito no POP POA/SLAV/15 e o formulário referente à curva de calibração desse ser arquivado de acordo com o POP POA/SLAV/09. ; Item 10: excluídos Anexo A MET POA/SLAV/31/01 Formulário Dados brutos - Determinação colorimétrica de fósforo Total em produtos de origem animal e Anexo C MET POA/SLAV/31/01 Formulário Validação da Planilha de Cálculos Determinação colorimétrica de fósforo total em produtos de origem animal. Substituído Anexo B por Anexo A ;

8 Página 8 de 8 Anexo A: Formulário Dados brutos - Determinação colorimétrica de fósforo Total em produtos de origem animal, excluído; Anexo B: agora Anexo A (Planilha Cálculos Determinação colorimétrica de fósforo total em produtos de origem animal ). Excluídos campos de registro de transcrições, verificação das transcrições, verificação e data; Anexo C: excluído. Não há necessidade de complemento de relatório de confirmação de desempenho em função das alterações realizadas. 12 Responsabilidades O Responsável pelo POA/SLAV deve garantir a elaboração, aprovação, emissão, distribuição de cópias, implementação, capacitação de pessoal para a correta execução, gerenciamento de não conformidades, análise crítica e revisão deste MET. O Responsável pelo POA/SLAV é responsável pela aprovação técnica deste MET. A UGQ é responsável pela verificação deste MET. Elaboração/Revisão: Aprovação: Verificação: Ana Paula Melo POA/SLAV Leandro Ploêncio POA/SLAV Cristhiane Cattani POA/SLAV Rosane Carlessi UGQ Data: 18/07/2014 Data: 25/07/2014 Data: 25/07/2014

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