Guia do Professor. (Documento baseado no guião original em inglês)

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1 Guia do Professor (Documento baseado no guião original em inglês) Nota: Este documento é apenas um resumo do conteúdo do guia do professor. Alguns itens de grande importância não estão aqui referidos, pelo que este texto não dispensa a leitura do guia do professor original. Sobre O Acaso na Natureza A actividade proposta consiste numa simulação prática de uma análise genética a uma família fictícia. Com esta actividade, os alunos consolidam conhecimentos teóricos de hereditariedade mendeliana clássica (autossómica e ligada ao sexo) e do uso de enzimas de restrição e electroforese em gel na identificação de variantes genéticas e padrões de hereditariedade. Além da teoria, a actividade integra, ainda, a componente tecnológica e promove a aprendizagem de técnicas laboratoriais de biologia molecular. O resultado de análises genéticas levanta, por vezes, questões éticas difíceis que poderão suscitar um debate interessante. É pedido aos alunos que determinem o padrão de hereditariedade de uma característica genética através da análise de amostras de DNA. São usadas enzimas de restrição para cortar o DNA em fragmentos que são, depois, separados por electroforese em gel. Seguidamente, o DNA é corado para que se torne visível e se possam analisar os resultados. Não é dito aos alunos de que característica genética se trata. O exercício pode ilustrar características genéticas reais, como o albinismo ou a anemia falciforme, ou características fictícias, conforme decisão do professor. Lembra-se, apenas, que deve ficar claro para os alunos que nem todas as características são resultado da acção de um único gene, algumas tem padrões de hereditariedade multifactoriais. 1

2 A história apresentada aos alunos Está-se a investigar o padrão de hereditariedade de um determinado gene. Foram recolhidas amostras de 24 membros de uma grande família e o DNA recolhido foi amplificado por PCR. Para o locus a ser investigado, existem dois alelos. Existem, por isso, três genótipos possíveis: DD, Dd e dd. A amplificação da região do DNA a estudar origina fragmentos de 6500 pares de bases para ambos os alelos. As amostras de DNA que fazem parte do kit contêm o DNA amplificado. O exercício envolve a determinação do tipo de DNA presente em cada amostra. Para isso, trata-se o DNA com uma enzima de restrição: a BamHI, e observa-se o resultado por meio de electroforese em gel. A sequência de restrição reconhecida pela BamHI só existe no alelo d, pelo que o alelo D não vai sofrer digestão enzimática. Isto significa que amostras de indivíduos com os três genótipos dão origem a um número de bandas diferente, dentro de três possíveis: uma banda de 6500 pb, alelo D não digerido, e duas bandas resultantes da digestão enzimática do alelo d: 4000 pb e 2500 pb. Genótip o Número de bandas Tamanho da(s) banda(s) DD pb Dd pb; 4000 pb; 2500 pb dd pb; 2500 pb Utiliza-se um DNA marcador na electroforese em gel para confirmar o tamanho dos fragmentos obtidos. A página 13 do guia do aluno apresenta o tamanho dos fragmentos existentes no DNA marcador. Timing 2

3 Antes da sessão prática com os alunos, o professor deve decidir qual o padrão de hereditariedade que os alunos vão investigar (autossómica recessiva ou ligada ao sexo). As amostras deverão, seguidamente, ser distribuídas de acordo com o esquema da figura da página 6 do guia do professor. As amostras deverão ser guardadas a - 20ºC até serem utilizadas. O gel de agarose também deve ser preparado antes da sessão prática pelo professor ou pelos alunos. A descrição do procedimento está na página 8 do guia do aluno. Neste exercício, pode-se utilizar o pente de quatro ou o pente de seis dentes. Quatro poços em oito tanques permite correr as 24 amostras e o DNA marcador. Se se usar o pente de seis, os poços excedentes podem ser usados para correr amostras dúbias segunda vez. Depois de os alunos misturarem o DNA com as enzimas de restrição, deve-se deixar os tubos a incubar durante min (conforme instruções no guia do aluno, página 7). Esta é a altura ideal para espalhar o gel de agarose nos tanques (conforme as indicações no guia do aluno, páginas 8 e 9). Depois do período de incubação, o DNA pode ser congelado para ser utilizado noutra aula. Os géis preparados podem ser guardados durante vários dias, desde que se assegure que eles não secam. Deve-se colocar um pouco de TBE nos tanques e colocálos num saco de plástico no frigorífico. O carregamento do gel demora cerca de 10 minutos. A 36 volts, demora cerca de 90 minutos a correr o gel. Mal as amostras parem de correr, deve-se corar os géis imediatamente, para impedir a difusão dos fragmentos de DNA. Corar o gel demora cerca de 10 minutos e as bandas tornam-se visíveis ao fim de 20. Será necessário entregar aos alunos uma fotocópia da árvore genealógica (página 7 do guia do professor) e uma cópia do DNA marcador (página 10 do guia do professor). 3

4 Material Itens que podem ser utilizados directamente do kit: Um rectângulo de material esponjoso com aberturas preso a uma rolha para colocação dos tubos na incubação Micropipeta (25 µl) Pontas amarelas para a micropipeta Enzima de restrição liofilizada BamHI (tubos azuis) Azul de bromofenol Tubos de microcentrifugação (para colocar as amostras de DNA) DNA marcador de 1 kb Guia do aluno (versão em português em: Itens que fazem parte do kit mas com preparação prévia: Três tipos de amostras de DNA, distribuídos pelo professor nos tubos de microcentrifugação (imagem pág. 6 guia do professor) Eléctrodos de tecido de fibra de carbono, cortados em tiras de aproximadamente 42 mm x 22 mm (páginas 8 e 9 do guia do aluno) Solução tampão TBE preparada a partir do concentrado fornecido com o kit, diluindo 1 parte de tampão em 9 partes de água destilada ou desionizada Nota: a solução tampão pode ser guardada e reutilizada 3 ou 4 vezes (mais indicações na página 13 do guia do professor) Gel de agarose a 0,8%, feito a partir da dissolução do pó de agarose num tampão de electroforese diluído. Nota: Não dissolva a agarose em água! A maneira mais fácil de dissolver a agarose é usar um microondas. É importante que a concentração de agarose esteja correcta. Não prepare um volume pequeno, faça, pelo 4

5 menos, 100 ml. Use o que precisar e guarde o resto. A concentração de gel pode aumentar devido à evaporação no reaquecimento, sendo preferível aquecer a agarose num recipiente graduado e compensar a perda adicionando água. O corante de DNA (quando diluído, 0,04% Azure A em 20% de etanol) preparado a partir do concentrado fornecido com o kit através da diluição do concentrado em igual volume de água distilada. Nota: O corante de DNA pode ser reutilizado várias vezes. Quando começar a ficar demasiado usado, poderá ser necessário deixar corar durante mais tempo que os 4 minutos sugerido no guia do aluno. Itens necessários mas não fornecidos: Uma fotocópia da árvore genealógica da página 7 do guia do professor por aluno Pilhas, e.g, tipo 6LR61 com uma voltagem combinada de 36 volts Luvas de protecção (por causa do corante de DNA) Uma caneta de acetato para identificar os tubos e os tanques Incubadora a 37ºC ou um banho-maria à mesma temperatura Incubadora a 65º ou um banho-maria à mesma temperatura As páginas 8 e 9 do guia do professor apresentam as árvores genealógicas com os resultados esperados para a hereditariedade autossómica recessiva e ligada ao sexo. As páginas 12 e 13 do guia do professor contêm indicações de segurança e instruções para o armazenamento e reciclagem de materiais. As páginas 14 e 15 do guia do aluno contêm as informações de segurança essenciais. O guia do professor contém, ainda, respostas a alguns problemas mais frequentes que podem ocorrer no desenvolvimento desta actividade. 5

6 Por último, deixamos uma sugestão. O professor deve ler com atenção o guia do aluno, porque muita da informação que os alunos podem deduzir na análise dos resultados da actividade está já expressa na introdução teórica. Recomenda-se, por isso, que o professor rearranje o guia de forma a tornar a actividade mais investigativa e menos demonstrativa e, consequentemente, mais pedagógica e atractiva. Inês Martins, Ciência Viva 6

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