PLANO DE MINICURSO TÍTULO DO MINICURSO: 60 ANOS DO DNA E OS AVANÇOS DA PRODUÇÃO AGROPECUÁRIA

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1 PLANO DE MINICURSO TÍTULO DO MINICURSO: 60 ANOS DO DNA E OS AVANÇOS DA PRODUÇÃO AGROPECUÁRIA OBJETIVO: Proporcionar aos participantes uma maior compreensão dos avanços que a descoberta da estrutura da molécula de DNA vem proporcionando para o desenvolvimento da produção agropecuária. Já que um dos grandes desafios hoje na Amazônia é aumentar a produtividade agropecuária de maneira sustentável. CARGA HORÁRIA: 8 horas FACILITADOR(ES): - Aline Medeiros Lima (Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Agronomia da UFRA) - Alan Edir Nahon (Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia da UFRA) - Diehgo Tuloza da Silva (Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular da UFPA) - Sávio Pinho Reis (Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da UFPA) PERÍODO: 31/10 e 01/11/2013, de 8:00 às 10:00 e de 14:00 às 16:00h. LOCAL: Parte Teórica Sala de aula a definir Parte Prática Laboratório de Biologia Molecular da UPFA NUMERO DE VAGAS: 15 alunos

2 CONTEÚDO PROGRAMÁTICO: 1. Introdução 1.1 A descoberta da estrutura do DNA e sua importância para o desenvolvimento da Biologia molecular 1.2 Técnicas de Biologia Molecular que possibilitaram avanços importantes na agropecuária. 2. Etapas Laboratoriais Necessárias para Isolamento e Clonagem de Genes de Interesse 2.1 Extração do DNA 2.2 PCR (reação em cadeia da polimerase) 2.3 Eletroforese 2.4 Clonagem 3. Biotecnologia aplicada à agropecuária 3.1 Avanços alcançados na agropecuária nos últimos anos. MATERIAL DIDÁTICO E INFRAESTRUTURA NECESSÁRIOS: Sala de aula para as partes teóricas Data-show para as aulas teóricas Canetas Quadro Impressão de matérias como textos e protocolos da aula prática Transporte dos alunos da UFPA para a UFRA após a prática (se julgar necessário). Caso as práticas não seja realizada na UFPA será necessário os materiais para a realização da prática ( protocolos em anexo) PRÉ-REQUISITOS: Ter cursado a disciplina de Genética

3 CRONOGRAMA: Data 31/10 01/11 Manhã: Teórico Tópicos/Atividades - A descoberta da estrutura do DNA e sua importância para o desenvolvimento da Biologia molecular - Técnicas de Biologia Molecular que possibilitaram avanços importantes na agropecuária. Tarde: Teórico Etapas Laboratoriais Necessárias para Isolamento e Clonagem de Genes de Interesse Manhã: Prático -Extração de DNA -PCR -Eletroforese Tarde: Teórico -Biotecnologia aplicada à agropecuária REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA: BORÉM, A. & FRITSCHE-NETO, R. Biotecnologia aplicada ao melhoramento de plantas. 1ª edição, Viçosa, Editora UFV, 2013, 336p. GRIFFITHS, A. J. F.; et al. Introdução à Genética. 9ª edição, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, p. PIERCE, B. A. Genética: Um enfoque conceitual. 3º edição Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011, 774p. RAMALHO, M. A. P.; et al. Genética na agropecuária. 5ª edição, Lavras, UFLA, 2012, 565p. SNUSTASD, D. P. & SIMMONS, M. J.;. Fundamentos de genética. 4ª edição, Rio de janeiro, Guanabara Koogan, 2008, 926p. VIANA, J.M.S.; CRUZ, C.D. & Barros, E.G. Genética. 2ª edição, Viçosa, Editora UFV, Vol. I, 2003, 330p.

4 Roteiro de aulas práticas Protocolo simplificado de extração de DNA de plantas Introdução: Os pesquisadores Watson e Crick elucidaram a estrutura dupla-hélice do DNA em 1953, um marco histórico que inaugurou a era da Genética Molecular. O trabalho desses cientistas revelou o mistério da molécula que contém a informação necessária para que qualquer organismo vivo nasça e se desenvolva, desde os seres humanos até as bactérias. Tal feito completou 60 anos e nunca se viu uma área do conhecimento avançar tanto. Objetivo: Extrair o DNA de plantas utilizando um protocolo simplificado Protocolo: 1- Preparar 25Ml de tampão de extração ( 10mM Tris-HCl ph: 8.0; 50mM EDTA ph:8.0; 50mM NaCl e 1% de SDS) a partir das seguintes soluções estoques: 1 M Tris-HCl ph: M EDTA ph: M NaCl 10% SDS ou 20% SDS Considerar a fórmula Ci.Vi= Cf.Vf, onde no caso do Tris: Vi x 1000mM = 10mM x 25 Ml = 0.25Ml = 250µL. Usar 250µL em 25 ml de tampão. 2- Macerar cerca de 0,5g de folhas jovens utilizando cadinho e pistilo; 3- Transferir o macerado para um tubo de plástico (eppendorf de 1,5 Ml) e adicionar 1 Ml de tampão de extração, misturar bem no vórtex; 4- Incubar a 65 C por minutos, misturando ocasionalmente; 5- Centrifugar rpm por 10 minutos; 6- Transferir o sobrenadante para um novo tubo, adicionar igual volume de isopropanol e observar a precipitação do DNA.

5 Roteiro de aulas práticas Reação em cadeia da polimerase (PCR) Introdução Em 1993, Kary Mullis, recebeu o prêmio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reação em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo. A PCR permite a produção de grandes quantidades de um determinado segmento de DNA in vitro a partir de uma pequena quantidade de DNA-molde, evitando assim a necessidade de introdução (clonagem) do DNA de interesse em bactérias. Esta técnica faz parte da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia. Objetivo: Amplificar um fragmento de DNA extraído de folhas (aula anterior). Protocolo: 1-Colocar os regentes listados abaixo para descongelar no gelo, menos a Taq DNA polimerase. 2- Calcular o Mix (sempre adicionando uma reação a mais que o necessário). Reagentes Quantidade para uma reação DNA 5µl H 2 O 35µl Tampão da Taq DNA polimerase 10X 5µl MgCl 2 dntps Primer sense Primer anti-sense Taq DNA polimerase 1.5µl 1.0µl 1.0µl 1.0µl 0,5µl Total 50 µl Quantidade para reações 3-Preparar o MIX num tubo eppendorf de 1,5 ml seguindo a ordem acima e homogenizar bem. 4-Distribuir o mix nos microtubos de PCR, homogenizar bem e dar um spin. 5- Colocar os microtubos no termociclador.

6 Roteiro de aulas práticas Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose 1% Introdução: A Eletroforese em gel foi introduzida cientificamente em 1939 por A.Tiselius e A.E. Kabat com o objetivo de separar partículas orgânicas. Ela é bastante útil quando queremos analisar o tamanho das moléculas obtidas ou checar o resultado de uma amplificação de DNA ou RNA. Objetivo: Preparar um gel de agarose para análise de ácidos nucléicos Procedimentos Preparação dos reagentes necessários 1. Preparar o TBE 10X TBE 10X (Composição para 2 litros) 110g de ácido Bórico 80 ml de Tris-EDTA 0,5 M, ph 8,0 Água destilada até completar 2 Litros 2. Após preparar o TBE 10X diluir para a concentração de 1X para preparar uso posterior. Preparação do gel: 1. Preparar a solução de agarose em frasco de Erlenmeyer. 0,5 g de agarose 50 ml de TBE 1X 2. Aquecê-la (até a fervura) em banho-maria ou forno de microondas até a sua completa solubilização. 3. Após a solubilização, a solução de agarose deve ser resfriada por alguns minutos e a ela devem ser adicionados 5 µl de uma solução de brometo de etídio. (Cuidado! O brometo de etídeo é mutagênico e cancerígeno). Depois disso, agitar a solução e vertê-la sobre a cuba de gel com o pente já montado. 4. Aguardar a gelificação a temperatura ambiente por 30 min. Preparação das amostras 1. Em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml misturar 5 µl de cada amostra de DNA de interesse e 3 µl de Dye. Eletroforese 1. Colocar o gel de agarose 1% na cuba de eletroforese e submergi-lo em TBE 1X. 2. Aplicar as amostras e o marcador no gel com uma micropipeta 3. Submeter as amostras a eletroforese a uma voltagem de 90V por aproximadamente 20 min. 4. Visualizar as amostras de DNA colocando o gel sobre transluminador com iluminação ultravioleta (Cuidado! O ultravioleta pode causar queimaduras e é mutagênico).

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