LABORATÓRIO DE BIOENGENHARIA. Métodos rápidos de tipagem de microrganismos

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Tiago Tuschinski Gesser
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1 LABORATÓRIO DE BIOENGENHARIA Métodos rápidos de tipagem de microrganismos Tradicionalmente, o estudo de microrganismos, a nível genético, bioquímico/fisiológico ou apenas a nível de identificação, requer o seu isolamento em culturas puras. Os procedimentos experimentais necessários para se isolar, purificar e identificar os microrganismos presentes numa determinada amostra são laboriosos e dispendiosos. Além disso, muitas vezes nem todos os organismos daquela amostra são isolados, uma vez que não se utilizaram as condições experimentais necessárias ao seu desenvolvimento (ex. composição química do meio de cultura, da atmosfera da cultura, temperatura, etc). As técnicas de Biologia Molecular têm vindo a ser utilizadas não só para conhecer a composição e funcionamento das células, mas também para estudar os microrganismos sem ter que os cultivar, como por exemplo o FISH (Fluorescent in situ Hybridization), que permite identificar organismos específicos numa amostra ambiental, recorrendo a sondas que irão hibridar especificamente com um gene alvo presente apenas no organismo que se quer identificar. Algumas técnicas de Biologia Molecular permitem também averiguar se dois organismos cultiváveis (ou mais) são iguais ou não. Estas últimas técnicas, ditas de tipagem, permitem estudar simultaneamente um grande número de organismos, pois permitem agrupá-los e compará-los com outros já estudados e caracterizados. Estas técnicas têm vindo a ser utilizadas, por exemplo, na comparação de isolados clínicos de uma unidade de saúde ao longo do tempo, ou em isolados clínicos de diferentes unidades de saúde. Uma vez que cada grupo de alunos escolheu um microrganismo entre 4 possíveis (2.a a 2.d), pretende-se que através de um método rápido de tipagem, no final do período laboratorial cada aluno saiba o que escolheu, por comparação dos perfis de restrição com amostras de referência, e quais são os colegas que estudaram o mesmo organismo. Cândida Manuel e Olga Nunes 1

Os procedimentos experimentais necessários para se isolar, purificar e identificar os microrganismos presentes numa determinada amostra são laboriosos e dispendiosos.

2 PARTE EXPERIMENTAL Extracção de DNA total - Com uma ansa estéril, retire 2/3 colónias de uma cultura em meio sólido. Ressuspenda a biomassa em 50 µl de água ultra pura estéril, num tubo Eppendorf estéril, devidamente identificado; - Coloque a suspensão (no tubo Eppendorf) num banho de água a 95 C, durante 10 minutos; - Transfira rapidamente o tubo Eppendorf para gelo. Deixe arrefecer durante 5 minutos; - Centrifugue a rpm durante 2 minutos; - Transfira o sobrenadante (DNA total) para um tubo Eppendorf estéril, devidamente identificado; - Guarde a amostra (no tubo Eppendorf) a -20 C. Electroforese em agarose para análise do DNA total - Prepare o gel de agarose misturando agarose com solução tampão TAE (40 mm Tris, 20 mm ácido acético, e 1 mm EDTA (ph 8.0), 1x), com concentração final de 0,7% (p/v). A mistura deve ser aquecida até fundir. Adicione a agarose ao gel caster, e deixe polimerizar durante cerca de 30 minutos. - Depois de polimerizado, coloque o gel na tina de electroforese contendo tampão TAE (1x). - Retire o pente, e com a ajuda de uma pipeta automática com ponta estéril adicione 6 µl de marcador de peso molecular no primeiro poço. - Prepare as amostras misturando 2 µl de loading buffer (azul de bromofenol/glicerol) com 8 µl de amostra de DNA total. - Aplique as amostras no gel adicionando os 8 µl de amostra + 2 µl loading buffer no poço seguinte (anote a posição do poço). - Corra a electroforese a 90 V, durante cerca de 35 a 50 min. Cândida Manuel e Olga Nunes 2

minutos; - Transfira rapidamente o tubo Eppendorf para gelo.

3 - Revele as bandas transferindo o gel para uma solução de brometo de etídio (ATENÇÃO CANCERÍGENO) durante cerca de 15 min. - Visualize das bandas de DNA colocando o gel num transiluminador (UV- ATENÇÃO CANCERÍGENO). Fotografe o gel para registo. Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) O RAPD é uma técnica de tipagem baseada na amplificação de fragmentos não específicos de DNA, utilizando um primer, pequeno e de sequencia arbitrária, como iniciador da amplificação do DNA genómico por PCR (Polymerase Chain Reaction). O tamanho dos fragmentos amplificados por PCR dependem do primer e do DNA genómico, e são posteriormente separados por electroforese em agarose. Neste estudo usar-se-ão 2 primers (M13 e OPA3) para tipar os microrganismos em estudo pela turma. Sequência dos primers: M13: 5 GAG GGT GGC GGT TCT 3 OPA3: 5 AGT CAG CCA C 3 Amplificação por PCR : Deve preparar-se um mistura de reacção (mix) que será depois distribuída por tubos Eppendorf de 200 µl estéreis e aos quais se adiciona a amostra de DNA para amplificar. Em cada Eppendorf de 200 µl adiciona-se 24,5 µl de mix + 0,5 µl da amostra (DNA total). Para identificar o organismo em estudo será necessário comparar os seus perfis de restrição (perfil de bandas de DNA obtido a partir da amplificação com cada um dos primers) com os de organismos de referência (4a a 4d), fornecidos pelas docentes. Deve sempre fazer-se um Branco (24,5 µl de mix + 0,5 µl da água ultra-pura estéril) para confirmar que a amplificação do DNA decorre como pretendido, ou seja, não deve haver amplificação de DNA nesta reacção. Cândida Manuel e Olga Nunes 3

Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) O RAPD é uma técnica de tipagem baseada na amplificação de fragmentos não específicos de DNA, utilizando um primer, pequeno e de sequencia arbitrária,

4 MIX para 1 reacção Água ultra pura 14 µl Tampão de reacção com KCl (10 x) 2,5 µl MgCl 2 25 mm 1,5 µl dntps 1 mm 5 µl Taq polimerase 1U/µL 0,75 µl Primer 33 pmol/µl 0,75 µl Volume total = 24,5 µl Como se utilizam dois primers diferentes (M13 e OPA) para amplificar o DNA da amostra, devem-se preparar dois controlos (brancos). Depois das reacções terem sido preparadas, devem colocar-se no termociclador para amplificar o DNA com o seguinte programa de temperaturas: - Desnaturação inicial (94 C, 5 min.) - 45 ciclos de: Desnaturação (94 C, 1min.) Annealing (34 C, 1 min.) Extensão (72 C, 2 min.) - Extensão final (72 C, 10 min.) O produto de PCR (devidamente identificado) deve ser guardado a -20 C. Separação dos fragmentos amplificados (obtenção do perfil de RAPD): Os fragmentos de DNA amplificados são separados em gel de agarose a 1,5% (p/v), usando 90 V durante 1,5 a 2 h. Em cada poço do gel, serão injectadas previamente 10 µl de amostra + 5 µl loading buffer na seguinte ordem: 1º Branco; 2º produtos PCR das amostras de referência dos microrganismos em estudo; 3º produtos PCR das amostras dos alunos; 4º marcador de peso molecular. Cândida Manuel e Olga Nunes 4

Depois das reacções terem sido preparadas, devem colocar-se no termociclador para amplificar o DNA com o seguinte programa de temperaturas: - Desnaturação inicial (94 C, 5 min.

5 O gel cora-se, visualiza-se e fotografa-se como descrito acima. A discussão dos resultados deve incluir a justificação dos seguintes pontos: a) caracterização do perfil de restrição obtido para cada primer; b) qual o melhor primer para tipar o microrganismo em estudo; c) a identificação do organismo em estudo; d) quantos e quais grupos de alunos estudaram o mesmo microrganismo. Cândida Manuel e Olga Nunes 5

perfil de restrição obtido para cada primer; b) qual o melhor primer para tipar o microrganismo em

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