Virologia em Laboratório Fase Pré- Analítica

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1 Virologia em Laboratório Fase Pré- Analítica Leonor Rebelo Lab Virologia i do IPOFGL EPE Novembro º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 1

2 ,, TÑÜxÇwxÜ t ØÇ vt vé át wx Öâx t ÅxÇàx ÇâÇvt áx vtçát? ÇâÇvt àxå ÅxwÉ x ÇâÇvt áx tüüxñxçwxa _xéçtüwé wt i Çv 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 2

3 INOVAÇÃO, RIGOR, EFICIÊNCIA 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 3

4 Esquema Geral Recursos humanos Desenho do laboratório e movimentação nas zonas de trabalho Protocolo de aceitação de amostras Equipamento Material de uso único Limpeza do laboratório Reagentes, primers e enzimas 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 4

5 Recursos Humanos Para se trabalhar num laboratório de Biologia Molecular são necessárias as seguintes características: Habilitações adequadas Experiência e treino em biologia molecularlar Conhecimento das regras do lab (manual) Protecção individual 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 5

6 Protecção individual id Protecção pessoal São todos os equipamentos destinados à protecção do pessoal de laboratório do contacto com os diferentes agentes, nomeadamente infecciosos, químicos e físicos. Evita também contaminação do material em análise. 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 6

7 Desenho do laboratório Sala de preparação de reagentes Preparação de reagentes stock Aliquotar reagentes (evita congelamentos e descongelamentos e contaminações cruzadas) Preparação de reagentes de PCR (inclui Master mix) Micropipetas Pontas com barreira de aerossóis Batas, luvas É recomendado que esta sala tenha pressão positiva 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 7

8 Desenho do laboratório Sala de preparação de amostras ou Pré PCR Manipulação de amostras Extracção de ácidos nucleicos (processo automático ou manual) Purificação DNA, RNA Micropipetas pp Pontas com barreira de aerossóis Batas, luvas 2 câmaras de fluxo laminar com um set de micropipetas próprio É recomendado que esta sala tenha pressão negativa 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 8

9 Desenho do laboratório Sala de amplificação e detecção ou pós PCR Termocicladores, Real time PCR Sequenciadores Micropipetas Tinas electroforese Transiluminador Material descartável (pontas com barreira de aerossóis, batas, luvas, etc) É recomendado que esta sala tenha pressão negativa IMPORTANTE Nada desta sala pode ser le ado para a sala preparação de IMPORTANTE: Nada desta sala pode ser levado para a sala preparação de reagentes e de pré PCR 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 9

10 Movimentação nas zonas Movimentação unidireccional ou marcha em frente de trabalho Codificação por cores de equipamento, reagentes, batas, etc Manuais de lab e notebooks não podem circular entre salas Uso de dados electrónicos Materiais não podem retornar da sala de Pós PCR para as salas de preparação de reagentes e de preparação de amostra Se houver uma quebra do workflow pode haver contaminação e todo o material e equipamentos devem ser limpos de acordo com o manual de procedimentos do laboratório. 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 10

11 Workflow ( Breve Esquema ) 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 11

12 Workflow 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 12

13 Protocolo de aceitação de amostras O Laboratório deve ter um protocolo devidamente divulgado para a recepção de amostras e deve incluir o critério de aceitação e as acções correctivas em caso de amostras que não cumpram os critérios (Manual de Colheitas). A amostra deve ser verificada por pessoal devidamente treinado para que a recepção cumpra alguns itens como por ex: Volume de amostra Temperatura de chegada (tubos provenientes de outros lab ou postos de colheita) Tempo de chegada adequado Marcação do tubo e toda a documentação anexa Amostra inválida Inibidores mais comuns: sais, ureia, hemoglobina, heparina, IgG s, etc 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 13

14 Protocolo de aceitação de amostras Após a recepção deve ser registado a data, hora e condições de recepção (informatizado) A amostra deve ser também marcada, registada e identificada com uma marcação única (ex :código de barras) 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 14

15 Protocolo de aceitação de amostras Que tipo de amostra? Plasma, Soro, LCR, Urina, LBA, Sémen, outros (presença de inibidores) Processamento das amostras /quantidade Armanezamento : Seroteca Digital/DNAteca DNA -20ºC RNA -80ºC Separação de áreas entre amostras e reagentes 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 15

16 Equipamento O equipamento usado nas técnicas de PCR é critico para a obtenção de bons resultados e deve haver um plano de manutenção de acordo com as especificações de cada tipo de equipamento: Inicio de trabalho e operação normal Calibração Reparação Registos em papel e electrónicos de reparações e de manutenção semanal, mensal, semestral e anual 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 16

17 Equipamento Termocicladores Estes aparelhos são essenciais para todos os métodos de PCR e devem ser manuseados com cuidado e deve ser assegurado que estes trabalham bem e produzem resultados fiáveis Plano de manutenção estabelecido para cada tipo de termociclador Devem ser revistos e calibrados pelo fabricante 2 x por ano Calibração de aparelhos de Real time PCR (excitação da fluorescência e detector de amplificação, ou no caso alinhamento de laser) deve ser executada 2 x por ano com kit fornecido pelo fornecedor 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 17

18 Equipamento Centrifugas Tinas de electroforese Fontes de alimentação Aparelhos de hibridação Sequenciadores Câmaras de fluxo laminar e hotes de extracção Luzes Ultravioleta (câmaras e salas) Banhos Maria secos Espectofotómetros, luminómetros e fluorímetros 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 18

19 Equipamento Micropipetas Devem existir sets de micropipetas de acordo com o trabalho que vamos realizar: Pré PCR Reagentes RNA DNA Real time Sequenciação Pós PCR Devido á pipetagem de pequenos volumes que os métodos de biologia molecular usam, todas as pipetas (volume regulável, fixo, multicanal, de repetição) devem ser calibradas 1X por ano por entidade acreditada (de preferência) Os relatórios emitidos devem ser analisados para que as melhores micropipetas sejam postas a uso e as que têm maiores desvios sejam calibradas. 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 19

20 Material de uso único Pontas de micropipeta Para trabalhar em PCR as pontas de micropipetas têm que ter filtro, isto é, protecção de aerossóis para que não haja contaminação da amostra e vice versa Devem ser estéreis DNAse free RNAse free Apirogénicas 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 20

21 Material de uso único Tubos de amostra e PCR/Placas de Real Time PCR Devem ser de polipropileno p p Devem ser estéreis DNAse free RNAse free Apirogénicos Os tubos de amostras congeladas devem ser centrifugados antes de se abrirem para que todos as gotas vão para o fundo 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 21

22 Luvas Sem pó Material de uso único Luvas descartáveis devem estar à disposição em todas as salas Devem ser mudadas quando se muda de sala ou sempre que necessário Protegem o operador mas também protegem as amostras das DNAses e das RNAses humanas Batas Não se pode utilizar a mesma bata nas diferentes salas, podese sim ter batas descartáveis em todas as salas e utilizá las por cima da bata habitual 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 22

23 Limpeza do laboratório Todas as superfícies do lab devem ser limpas com hipoclorito de sódio a 0.5% Pode também ser usado detergente para todas as superfícies, limpeza com água e posterior limpeza com álcool a 70º Estas soluções inactivam agentes patogénicos e destroem ácidos nucleicos Existem produtos comerciais para limpeza de superfícies especificamente concebidos para remoção de ácidos nucleicos que também podem ser usados 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 23

24 Limpeza do laboratório Td Todo o material ilde electroforese e tabuleiros tbli de hibid hibridação, deve ser passado por água e lavado com detergente suave e água As câmaras de fluxo laminar devem ser limpas 1X por semana Todo o material contaminado biologicamente deve ser autoclavado a 121º C durante 90 min 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 24

25 Reagentes Reagentes, primers e enzimas Comerciais i ou preparados in house Mantê-los livres de contaminações Reagentes seguem as boas práticas laboratoriais i e o rótulo deve conter: Nome Validade Informação importante como concentração e data de reconstituição A mistura de diferentes lotes não deve ser feita excepto se confirmado por validação funcional 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 25

26 Reagentes,,primers e enzimas Água molecular l grade ou o seu equivalente comercial pode ser usada e tem que ser: Estéril DNAse free RNAse free Apirogénica Todos os reagentes se possível devem ter molecular grade. Os que vêm preparados comercialmente devem ser armazenados de acordo com as especificações do fabricante. Novos lotes devem ser previamente testados com um controlo Reagentes preparados in house devem ter critérios definidos para datas de validade, de funcionalidade e condições de armazenamento. Tampões devem ser regularmente verificados pois podem formar precipitados it ou contaminações. 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 26

27 Primers e sondas Reagentes, primers e enzimas Sensíveis Específicos Primers para qpcr com SYBR Green ou TaqMan (15-25pb) Comerciais ou obtidos in house Não podem ter contaminações com outras sequências ou enzimas Têm que possuir um certificado de qualidade que inclui: Sequência Método de purificação (ex.hplc) Concentração 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 27

28 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 28

29 Purificação High performance liquid chromatography (HPLC) Sequencia do primer 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 29

30 Caracteristicas de um bom primer: Tm entre 50º 65ºC Tamanho pb Reagentes, primers e Ausência de capacidade de dimerização enzimas Inexistência de locais secundários de annealing na sequência alvo Ausência significativa de formação de clamps (>3pb) 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 30

31 Reagentes,,primers e enzimas Cada novo lote tem que ser testado para contaminações utilizando para o efeito um controlo negativo Tem que se fazer também uma validação funcional dos novos lotes em comparação com os lotes a uso e serem rejeitados se a performance for significativamente diferente, no caso de Real time PCR esta avaliação faz-se comparando a eficiência Devem ser armazenados entre -20ºC e -70ºC em tampão TE ou em água molecular grade 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 31

32 Enzimas Reagentes, primers e enzimas As enzimas são uma ferramenta essencial dos procedimentos de PCR Devem ser compradas com certificado de qualidade d que assegure a pureza e deve conter informação sobre a actividade da enzima Devem ser testados os novos lotes para nos certificarmos da actividade O armazenamento (instruções do fabricante) mas geralmente armazenam-se a -20º C e nunca devem ser deixadas á temperatura ambiente (manter em gelo enquanto pipetamos as Misturas de Reacção) 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 32

33 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 33

34 ÂaâÇvt wx åx Öâx É ÅxwÉ wx xüütü É ÅÑx t wx }ÉztÜÊ Âb ÅÑÉÜàtÇàx véçà ÇâtÜ Öâxáà ÉÇtÇwÉÊ TÄuxÜà X Çáàx Ç 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 34

35 A equipa que faz a diferença! 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia 35

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