PCR tempo real. PCR quantitativo. 52º Congresso Nacional de Genética Foz do Iguaçu

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1 PCR tempo real PCR quantitativo 52º Congresso Nacional de Genética Foz do Iguaçu

2 Aspectos Básicos um dos métodos atuais de aferir o nível de expressão de genes mas não é o único: Northern blotting (quantificação de mrna) baseado na ação da enzima transcriptase reversa Construção de DNA Microarrays (justificável para um número muito elevado de amostras)

3 Aspectos Básicos metodologia que se baseia na técnica de PCR (Mullis,1986) com adequações para um nível de sensibilidade muito maior técnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do nº de moléculas produzidas ciclo a ciclo daí a denominação PCR em tempo real

4 Reação em cadeia da polimerase PCR

5 Aspectos Básicos hipótese central: variações do nº de cópias de um produto gênico indica a importância hierárquica deste produto para a vida da célula tudo a ver com a função deste produto gênico no ambiente celular as mudanças fisiológicas estão correlacionadas com as mudanças dos níveis de expressão dos genes exemplos: resposta imune; resposta farmacológica, etc

6 Aspectos Básicos usos desta técnica avaliação quantitativa dos níveis de expressão de genes metabolismo celular estabelecimento da importância dos produtos gênicos para cada tipo de célula estudado desenvolvimento de estratégias visando minimizar os efeitos de um produto gênico inadequado (drug design) desenvolvimento de drogas específicas para situações específicas patologias modificações de níveis de expressão de genes normais, etc

7 PCR (Mullis,1986) reagentes necessários amostras de DNA molde oligonucleotídeos iniciadores (primers) Taq DNA polimerase dntps(atp;gtp;ttp e CTP) termociclador

8 PCR (Mullis,1986) eletroforese Brometo de Etidio

9 Cuidados específicos da PCR (Mullis,1986) controles adequados controle negativo (geralmente H 2 O DNA) curva de sensibilidade (quantidade de DNA) controle interno controle de contaminação com DNAs de outras origens

10 Vantagens da PCR (Mullis,1986) sensibilidade versatilidade acessar diferentes genes simultaneamente custo insignificativo dos primers confiabilidade comparações de resultados entre experimentos (existência de controles adequados) controles adequados

11 Desvantagens da PCR (Mullis,1986) etapas de otimização para cada abordagem a ser avaliada temperatura de pareamento nº de ciclos quantidade de primers etc

12 PCR quantitativo (real time) muitas similaridades com a PCR (Mullis,1986) emprego de primers, DNAs molde, polimerase e nucleotídeos diferenças com a PCR (Mullis, 1986) máquina especial corantes especiais procedimentos de otimização diferentes

13 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System

14 7500 Real-Time PCR System

15 7500 Real-Time PCR System

16 PCR tempo real questões relativas à abreviações não utilizar RT-PCR (reverse transcription PCR) para se referir a PCR tempo real Real time RT-PCR significa a condução de experimentos de RT-PCR (reverse transcription) utilizando um sistema de PCR tempo real

17 PCR tempo real corantes fluorescentes SYBR green Applied Biosystems TaqMAN Applied Biosystems Molecular Beacons LUX Invitrogen Annealing phase method - FRET method, non-quenching *New Exiqon Probe Library

18 PCR tempo real SYBR green (Applied Biosystems) liga-se exclusivamente a DNA duplex fluorescência aumenta 20X quando ligado a DNA duplex não discrimina entre produtos desejados e não desejados (uma vez que não há pareamento de bases) método mais barato de todas as opções funciona baseado no aumento da fluorescência indicando aumento de material genético específico amplificado

19 SYBR green (Applied Biosystems)

20 SYBR green (Applied Biosystems)

21 PCR tempo real TaqMan (Applied Biosystems) corante mais adequado ao uso em PCR tempo real baseado na utilização de três produtos dois primers (específicos para o(s) gene(s) de interesse) um terceiro primer que pareia internamente (entre os primers acima referidos) características do terceiro primer contém dois compostos especiais: um fluorescente e outro denominado quencher (continua)

22 Características de pareamento dos primers 1º primer 2º primer 3º primer

23 PCR tempo real características do terceiro primer este primer é degradado pela atividade exonuclease da Taq polimerase como conseqüência há a redução da FRET (fluorescence resonance energy transfer) entre o corante fluorescente e o quencher

24 Atividade de exonuclease da Taq polimerase

25 PCR tempo real LUX (light upon extention) a sonda é bloqueada quando se forma um hairpin a forma extendida apresenta sinal mais intenso a sonda incorporada produz o sinal mais forte aumento de fluorescência devido a aumento de produção de produto gênico

26 PCR tempo real Método da fase de pareamento também usa tres sondas um dos primers é fluorescente o terceiro que se pareia entre os primers que definem o alvo é também fluorescente o pareamento dos primers fluorescentes (1º e 3º) produz FRET (fluorescence resonance energy transfer) durante a fase de pareamento aumento da fluorescência indica maior expressão do(s) gene(s) alvo

27 PCR tempo real método do quenching semelhante ao TaqMan mas ao invés de usar um quencher busca-se a queda dos valores de fluorescência do segundo corante fluorescente.

28 PCR tempo real usos do PCR tempo real análise de expressão gênica análise de splice alternativo carga viral (diagnósticos clínicos) analise de mutações discriminação alélica detecção de transgênicos etc...

29 Preparação de RNA métodos Trizol ou outros métodos baratos que produzam RNA de baixa qualidade (e portanto requerem purificação posterior) RNeasy - ~$3 por reação

30 Proposta experimental usar amostras em réplicas (reais) estabelecer curva padrão padrão com água controle de RNA/DNA genômico curva de dissociação

31 Proposta experimental é considerado útil utilizar diferentes tubos de uma mesma amostra para avaliar erros de pipetagem recomendado para situações onde ocorrem diferenças muito pequenas nos níveis de expressão gênica previsão orçamentária para este tipo de controle

32 Erros de pipetagem Eppendorf P10 Pipette Percentage Volume Inaccuracy Imprecision

33 Erros de pipetagem pipete o maior volume possível dentro do intervalo adequado para seu trabalho de modo a evitar erros de pipetagem dilua suas amostras quando possível de modo a ser possível pipetar volumes maiores

34 Proposta experimental confecção da curva padrão fazer a escolha do nº de pontos (5 em geral) preparar diluições seriadas (por ex.1:2) realizar as amplificações sob condições otimizadas (sem haver limite de reagentes) Applied Biosystems (TaqMan) afirma não necessitar de curva padrão (será mesmo?) amplicons com nº de cópias nem sempre é possível atingir 100% de eficiência

35 Construção da curva padrão

36 Uso da curva padrão C T C T C T é diretamente proporcional ao log de quantidade inicial de DNA / RNA Log n cópias

37 Equação da reta X Eficiência de Amplificacão declividade reflete a eficiência de amplificação. Eficiência de amplificação = 100% Log [Molde]

38 Saída de dados pelo ciclador declividade reflete a eficiência de amplificação.

39 Proposta experimental branco (água) avaliar a presença de dímeros dos primers nas reações especialmente com primers feitos para usar o corante SYBR-green os corantes que utilizam uma 3ª sonda (TaqMan, Molecular Beacons, etc) não apresentam este problema

40 Proposta experimental controle da fonte de molde (RNA ou DNA genômico) possibilidade de presença de DNA genômico contaminando as preparações de mrna) falso positivo procurar elaborar primers que incluam uma região exon/intron (tirar vantagem do splicing) presença de DNA genômico interfere com os controles onde não deve haver amplificação

41 Proposta experimental curva de dissociação (SYBR-green) aquece lentamente as amostras de 60 C (pareamento/elongação) para 95 C aferição da fluorescência das medidas em cada temperatura diferentes amplicons se dissociam em diferentes temperaturas está é uma boa maneira de avaliar a presença de mais de um tipo de amplicon nos tubos de reação

42 Curva de Dissociação

43 Curva de Dissociação Primeira Derivativa

44 Proposta experimental considerações importantes problemas com PCR tempo real são usualmente devidos à presença de contaminação com ácidos nucléicos, quantidade e qualidade das amostras de mrna (ensaio de transcrição reversa) procure usar quantidades iguais de mrna para o ensaio de transcrição reversa erros de pipetagem contribuem dramaticamente a relevância deste tipo de problema com resultados esperados

45 Proposta experimental controle endógeno (controle interno) usado para normalização dos resultados escolha baseada em: gene com expressão relacionada com a do material que esta sendo avaliado gene não submetido a padrões de controle muito estringentes pode existir mais de um tipo de controle endógeno estes valores são utilizados para validar os resultados obtidos (normalização)

46 Análise dos Resultados itens a serem considerados após a 1ª corrida com primers novos existência de uma curva padrão branco com água (presença de dímeros) curva de dissociação (presença de dímeros) condições das amostras de mrnas

47 CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY Valores crescentes que refletem o nº de amplicons produzidos em cada situação AMOUNT OF DNA Valores crescentes que refletem a quantidade de DNA produzida em cada situação 10,000,000,000 1,000,000, ,000,000 10,000,000 1,000, ,000 10,000 1, % EFF 90% EFF 80% EFF 70% EFF PCR CYCLE NUMBER

48 CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY Após 1 ciclo 100% = 2.00x 90% = 1.90x 80% = 1.80x 70% = 1.70x Após N ciclos: o aumento será = (eficiência) n (E) n

49 Análise dos Resultados Tn=T 0 (E) n Tn = Numero de moléculas de DNA no ciclo de referência (CT) T 0 = numero inicial de moléculas DNA E = Eficiência da PCR (0<E<1)

50 Análise dos Resultados Threshold Ciclo de referência Amostra +R n ΔR n R n R n C T sem molde numero do ciclo

51 Padrão ótimo de curva de amplificação

52 Padrão sofrível de curva de amplificação

53 Padrão ruim de curva de amplificação

54 Resultados considerados bons

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