Lâmina adesiva vedante 3 Plástico e cola

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1 RTS120 MTB Q PCR Alert Kit Instruções de Uso USO PRETENDIDO O Kit MTB Q-PCR Alert Kit é um ensaio qualitativo de amplificação de ácidos nucleicos para a detecção de DNA de Mycobacterium tuberculosis (MTB) em amostras de DNA extraídas de escarro, exsudatos e urina. Em adição o ensaio detecta também o DNA de M. bovis. Seu uso pretendido é o de, juntamente com dados clínicos e outros exames de laboratório, diagnosticar e monitorar a infecção de MTB. O kit vem pronto para uso, sendo que pode realizar até 96 testes/amostras. PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO O procedimento envolve uma reação de amplificação em Tempo Real em microplaca em um equipamento com termostato programável fornecido com sistema óptico de detecção fluorescente (RT-PCR = termociclador em tempo real). Uma reação de amplificação específica para uma região do gene IS6110 do MTB e do controle interno, uma região do gene humano TNF usando o DNA extraído das amostras. Uma sonda específica para MTB é marcada com o fluoróforo Yaka Yellow TM (similar ao fluoróforo VIC TM ) e é ativada quando hibridizada com um produto específico da reação de amplificação do MTB. A sonda específica para o controle interno está marcada com fluoróforo FAM e é ativada quando hibridizada com o produto da reação de amplificação para a região do gene humano TNF. A emissão de fluorescência aumenta com o aumento da reação de amplificação do produto específico, e é medido e registrado pelo equipamento. A análise de dados torna possível determinar a presença e o título de DNA MTB na amostra inicial. A partir do momento que a sonda TaqMan for ligada à parte específica do 1

2 gabarito de DNA. depois da desnaturação (alta temperatura) e resfriamento da reação, os primers se anelam ao DNA. A TaqPolimerase, então, adiciona nucleotídeos e remove a sonda TaqMan do DNA alvo. Isso separa o quencher do repórter e permite ao repórter emitir sua energia. Isso é, então, quantificado usando um computador. Quanto mais ocorrer a desnaturação e anelamento, mais oportunidades a TaqMan terá de se ligar, e em contra partida, mais luz emitida será detectada. O corante do repórter é liberado da dupla fita de DNA criada pela Taq Polimerase. Longe do corante quencher, a luz emitida do corante repórter dye em estado excitado pode, agora, ser observada. A padronização do sistema foi realizada nos instrumentos da Applied Biosystems ABI PRISM série COMPONENTES FORNECIDOS Componente Descrição Quantidade Composição MTB Q-PCR MIX RTS120 MTB Controle Positivo RTS120 DNA Controle Interno Acessórios Mistura completa de reação para amplificação em tempo real 4 x 520 µl Oligonucleotídeos, Oligonucleotídeos fluorescentes, TRIS cloridrato, Glicerol, MgCl2, ROX, deoxiribonucleotídeo trifosfato, uracil N glicosidase, Taq DNA polimerase hot start Plasmídeo, TRIS base, TRIS cloridrato, EDTA Solução de plasmídeo para controle positivo 4 x 50 µl Solução de plasmídeo Plasmídeo, TRIS base, para controle interno de 8 x 250 µl TRIS cloridrato, EDTA inibição Microplaca com 96 pocinhos de 0,2 ml 3 Plástico PP Lâmina adesiva vedante 3 Plástico e cola MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS Equipamentos: - Capela de fluxo laminar - Agitador tipo Vórtex - Microcentrífuga de mesa ( RPM) 2

3 - Micropipetas simples, volume variável - Real Time ABI PRISM 7000, completo com microcomputador Material de Consumo: - EPI - Ponteiras com filtro - Água ultrapura - Tubos de microcentrifugação (1,5 ml a 2,0 ml) Amostras: - DNA extraído por metodologia definida pelo usuário, seguindo as normas e padrões de amostras exigidos na descrição a seguir. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO Componente MTB Q-PCR MIX Referência modelo Quantidade Estocagem 4 x 520 µl -20 C MTB Controle Positivo RTS120 4 x 50 µl -20 C DNA Controle Interno 8 x 250 µl -20 C Temp. Microplaca para amplificação 3 Ambiente RTSACC01 Temp. Lâmina adesiva para amplificação 3 Ambiente PRECAUÇÕES Este kit é reservado para uso exclusivo em diagnóstico in vitro. Manuseio: ao manusear o kit e as amostras, utilizar EPI adequado ao tipo de laboratório onde os testes serão realizados, devido à natureza da amostra material biológico humano. Tratar como potencialmente infeccioso. Não beber ou comer na área de trabalho. A área de trabalho deve ser um ambiente limpo e com ventilação adequada. Trabalhar dentro de capela de exaustão / fluxo laminar. Não manusear o kit sem luvas. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas, reagentes e materiais usados como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contato direto com as amostras biológicas. Evitar a formação de aerossol durante o procedimento evitar respingar material ao redor da área de trabalho ou fora dela. O material que está em contato com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3 % por pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121 C durante uma hora antes de ser eliminado. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contêm ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Não pipetar nenhuma solução com a boca. 3

4 Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar reagentes e resíduos conforme as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste. Respeitar as instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit. Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não misturar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extração, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal especializado para evitar o risco de resultados incorretos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucleicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extração/preparação das reações de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação (áreas de pré e pós-pcr). Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extração/preparação das reações de amplificação. É necessário uso de EPI adequado a cada uma das áreas de trabalho em laboratório de biologia molecular. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas em uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contêm amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo, ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma única vez. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para aquela área de trabalho. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo, ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para sua área de trabalho. Advertências e precauções específicas para os componentes O MTB Q - PCR MIX pode ser descongelado somente uma vez. Novos ciclos de congelamento/descongelamento podem causar perda em seu desempenho. O MTB Q - PCR MIX pode ser armazenado no escuro a +2 / +8 C por no máximo 4 dias. O MTB Q - PCR MIX traz os seguintes alertas de segurança (S): S Não respirar seu gás/fumaça/vapor/spray. Evitar contato com os olhos. O MTB Controle Positivo pode ser congelado e descongelado por não mais que 12 vezes. Novos ciclos de congelamento e descongelamento podem causar perda no título. 4

5 O MTB Controle Positivo traz os seguintes alertas de segurança (S): S Não respirar seu gás/fumaça/vapor/spray. Evitar contato com os olhos. O Controle interno de DNA pode ser congelado e descongelado por não mais que 12 vezes. Novos ciclos de congelamento/descongelamento podem causar perda no título. O DNA Controle Interno traz os seguintes alertas de segurança (S): S Não respirar seu gás/fumaça/vapor/spray. Evitar contato com os olhos. CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA Este produto é para ser usado com DNA extraído de amostras de escarro, exsudato e urina. As amostras de escarro, exsudato e urina para a extração de DNA precisam ser coletadas de acordo com normas de boas práticas do laboratório para métodos de cultura, transportados a +2 /+8 C e armazenado a +2 /+8 C pelo período máximo de três (3) dias. Amostras de escarro podem ser congeladas e armazenadas a -20 C pelo período máximo de 30 dias ou a -70 C por períodos mais longos. Recomenda-se dividir as amostras que serão congeladas em alíquotas no sentido de prevenir repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Tratar as amostras como potencialmente infecciosas, utilizando-se do todas as precauções cabíveis para este fim. O DNA extraído da amostra inicial não pode conter mucoproteínas ou hemoglobina no sentido de prevenir o problema de inibição e a possibilidade de resultados frequentes inválidos. Não existe dado disponível com relação à inibição causada por drogas antivirais, antibióticos, quimioterápicos ou imunossupressores. ROCESSO DE MEDIÇÃO A preparação da medição, com todas as operações necessárias à utilização correta do produto, incluindo as instruções adequadas para reconstituição, mistura diluição ou outra forma de preparo dos reagentes de trabalho, bem como citação das especificações do diluente a ser utilizado: O MTB Q-PCR Alert Kit é um kit completo e que vem pronto para uso, possuindo os seguintes componentes: MTB Q-PCR MIX Uma mistura completa pronta para uso para a reação de e amplificação em tempo real em uma solução estabilizada, vem aliquotada em 4 tubos. Cada tubo contém 520 µl de solução, suficiente para 24 testes. Os primers e a sonda (marcadas com fluoróforo Yaka Yellow TM e bloqueadas por um quencher não fluorescente) para MTB são específicas para a região gênica IS6110 do MTB. Os primers e a sonda (marcadas com fluoróforo FAM e bloqueadas por um quencher não fluorescente) para o controle interno são específicas para o gene humano 5

6 TNFα. A mistura de reagentes fornece o sistema de tampão, cloreto de magnésio, nucleotídeos trifosfato, fluoróforo ROX (como a referência passiva para normalizar a fluorescência), a enzima Uracil-N-glicosidase (UNG, para inativar as contaminações possíveis do produto da amplificação) e a enzima hot start Taq DNA polimerase. MTB Controle Positivo Um DNA de plasmídeo pronto para uso para o controle positivo na solução estabilizada, aliquotada em dois tubos. Cada tubo contém 65 µl de solução, suficientes para 12 sessões de amplificação. O plasmídeo contém uma sequência amplificada da região genômica IS6110 do MTB. Este plasmídeo é detectado por uma reação de amplificação em tempo real para o MTB atestando a correta execução do procedimento de amplificação. DNA Controle Interno Um DNA de plasmídeo pronto para uso para o controle interno em uma solução estabilizada, aliquotado em oito tubos. Cada tubo contém 250 µl de solução, suficiente para 12 sessões de extração. O plasmídeo contém uma sequência amplificada do gene humano TNFα. Durante o procedimento de extração 20 µl desse plasmídeo é adicionado a cada amostra no sentido de fornecer o alvo para o sistema de controle de inibição. Esse plasmídeo é detectado pela reação de amplificação em tempo real para o controle interno atestando a correta execução do procedimento de extração. *O produto permite 96 determinações, incluindo os controles. O procedimento envolve uma reação de amplificação em Tempo Real em microplaca em um equipamento com termostato programável fornecido com sistema ótico de detecção fluorescente (RT-PCR = termociclador em tempo real). As técnicas de utilização dos reagentes e dos demais componentes do produto, descrevendo os volumes utilizados, os tempos requeridos em cada etapa ou fase, as condições ambientais, bem como os ajustes dos instrumentos de medição do produto, da técnica ou da reação: Preparo da etapa de amplificação real time área de pós-pcr Antes de iniciar, é necessário: - ligar o termociclador, ligar o computador controle, acessar o software e abrir a sessão quantificação absoluta ; - ajustar o detector para a sonda MTB com o repórter como VIC (adequado para Yakima Yellow TM ) e o quencher como none (quencher/bloqueador não fluorescente); - ajustar o detector para a sonda do controle interno com o repórter como FAM e o quencher como none (quencher/bloqueador não fluorescente) - para cada poço usado na microplaca, ajustar os detectores (tipo de fluorescência que deve ser medida), a referência passiva como ROX (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reação (amostra, controle de 6

7 amplificação negativa, controle positivo de amplificação, padrão de quantidade conhecida). Adicione esta informação à planilha que se encontra ao final desta Instrução de Uso, ou imprima a disposição da microplaca organizada. Siga cuidadosamente a planilha durante a transferência da mistura de reação e as amostras nos poços. Abaixo há um exemplo de como organizar a análise de 14 amostras. Legenda: S1 - S14: Amostras a serem analisadas; NC: Controle Negativo de amplificação; PC: Controle Positivo de amplificação. - Programar no termociclador os parâmetros do ciclo térmico e o volume de reação para 25 µl. Para equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM TMda série 7000 escolher a opção "9600 emulation". Ciclo térmico para amplificação Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 min. Desnaturação inicial 95 C 10 min. 95 C 15 seg. Amplificação (45 ciclos) 60 C 1 min. Preparação da amplificação (Realizado na área de extração/ preparação da reação de amplificação) Antes de iniciar, é necessário: - Retirar e descongelar os tubos contendo as amostras a serem analisadas. Centrifugar os tubos para que o material desça para o fundo do tubo e mantr em gelo; - Retirar e descongelar os tubos MTB Q-PCR MIX necessários para o processo lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 24 reações. Agitar suavemente, centrifugar os tubos por 5 segundos (pulso) para que os reagentes desçam para o fundo; - Retirar e descongelar o tubo de Controle Positivo MTB. Agitar suavemente, efetuar um pulso nesses tubos (centrífuga) para que seu conteúdo desça para o fundo tubo; manter em gelo. 7

8 Se necessário corte a placa de amplificação para separar a parte que será utilizada no ensaio, tomando o devido cuidado de manipulá-la com luvas sem talco e de não causar danos aos poços. 1. Transferir 20 µl de MTB Q-PCR MIX no fundo do poço da microplaca de amplificação, de acordo com o elaborado na planilha. NOTA: Caso não seja utilizada todo o MTB Q-PCR MIX, armazene o tubo no escuro a +2 /+8 C por no máximo catorze (14) dias. Não congele novamente esta solução. 2. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo de seu respectivo poço, 5 µl de DNA extraído, conforme posição definida na planilha elaborada. Prosseguir da mesma forma para as demais amostras de DNA extraídas. 3. Transferir, depositando cuidadosamente no fundo do poço de controle negativo, 5 µl de água ultrapura. 4. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo de seu respectivo poço, 5 µl de controle positivo, conforme posição definida na planilha elaborada na mistura de reação. 5. Selar a Microplaca de amplificação com a Lâmina adesiva de amplificação. 6. Transferir a placa de amplificação para o termociclador para tempo real, que deve estar em área específica de amplificação/ detecção e inicie o ciclo de amplificação. CALIBRAÇÃO DO PROCESSO Não é o caso, pois não existe procedimento de calibração para a metodologia em questão. CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS Análise qualitativa dos resultados Os valores de fluorescência emitida pela sonda específica para o MTB (FAM) e pela sonda específica para o Controle Interno (VIC) na reação de amplificação devem ser analisados pelo software específico. Antes de analisar, consultar o manual do equipamento e: - selecionar a opção Auto Baseline para o cálculo do nível de fundo fluorescente (Baseline); - programar manualmente o Limiar (Thereshold) para a fluorescência FAM para 0,2; - programar manualmente o Limiar (Thereshold) para a fluorescência VIC para 0,2. Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas específicas na reação de amplificação e o valor de Threshold permite determinar o Cycle Threshold (ct), ciclo no qual a fluorescência alcançou o valor de Threshold. Na reação de amplificação do Controle Positivo, o valor de ct da sonda específica para o MTB é usado para validar a amplificação e detecção conforme mostrado na tabela 8

9 a seguir: ct Controle Positivo MTB (FAM) Resultado Amplificação/Detecção ct 31 Positivo Correto Se a reação de amplificação do Controle Positivo é ct > 31 ou Indeterminado, significa que o DNA alvo não foi corretamente detectado. Um problema ocorreu durante a fase de amplificação ou detecção (volume das misturas de reação incorreto, degradação da sonda, degradação do controle positivo, dispensação incorreta do controle positivo, configuração incorreta da posição do controle positivo, configuração incorreta do ciclo térmico) que pode ter levado a resultados incorretos. A sessão é inválida e deve ser repetida da fase de amplificação. Na reação de amplificação do Controle Negativo, o valor de ct da sonda específica para o MTB é usado para validar a amplificação e detecção conforme mostrado na tabela a seguir: ct Controle Negativo MTB (FAM) Resultado Amplificação/Detecção Indeterminado Negativo Correto Se a reação de amplificação do Controle Negativo é diferente de Indeterminado, a presença do DNA alvo foi detectada. Isso significa que problemas ocorreram na fase de amplificação (contaminação) que podem ter levado a resultados incorretos e falsos positivos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Na reação de amplificação de cada amostra, o valor do ct da sonda específica para o MTB é usado para detectar a presença do DNA alvo. Na reação de amplificação de cada amostra, o valor do ct da sonda específica para o Controle Interno é usado para validar a amplificação, detecção e extração. Este ensaio tem um limite de detecção de 10 genomas MTB por reação (ver Características de Desempenho do Produto). Os resultados do ct para cada amostra são interpretados conforme mostrado na tabela: MTB (FAM) ct da Amostra ct Indeterminado ct Determinado Controle Interno (VIC) ct > 35 ou ct indeterminado Adequação da Amostra Resultado da Análise MTB DNA Inadequada Inválida - ct 35 Adequada Válida, Negativa ct > 35 ou ct indeterminado NÃO DETECTADO Adequada* Válida, Positiva PRESENTE ct 35 Adequada Válida, Positiva PRESENTE Se o resultado da reação de amplificação da amostra é ct indeterminado para MTB e ct > 35 ou indeterminado para o controle interno, isto significa que o DNA do Controle Interno não foi detectado de forma eficiente. Neste caso, problemas ocorreram durante a fase de amplificação (amplificação inválida ou ineficiente) ou na fase de 9

10 extração (ausência de DNA ou presença de inibidores) os quais podem causar resultados falsos negativos. A amostra não é adequada, o ensaio é inválido e precisa ser repetido desde a extração de uma nova amostra. Se o resultado da reação de amplificação de uma amostra é ct indeterminado para MTB e ct 35 para o Controle Interno, isto significa que o DNA MTB não foi detectado no DNA obtido a partir da amostra, mas não é possível excluir a presença de DNA em título menor que o limite de detecção do produto (verificar Características de Desempenho). Neste caso o resultado seria um falso negativo. Os resultados obtidos com este ensaio devem ser interpretados levando em consideração todos os dados clínicos e os outros testes laboratoriais efetuados no paciente. Obs.: quando o DNA do MTB é detectado na reação de amplificação da amostra a amplificação do Controle Interno pode resultar em ct > 35 ou indeterminado. De fato, a baixa eficiência da reação de amplificação do Controle Interno pode ser ocasionada pela alta eficiência da reação de amplificação do DNA de MTB. Neste caso, a amostra é adequada e o resultado positivo do teste é válido. LIMITAÇÕES DO PROCESSO Usar somente DNA extraído das seguintes amostras humanas com o produto: escarro, exsudato e urina. Não utilizar com este produto o DNA extraído das amostras heparinizadas: a heparina inibe a reação de amplificação dos ácidos nucleicos e causa resultados inválidos. Não utilizar com este produto DNA extraído contaminado com mucoproteínas ou hemoglobina. Estas substâncias inibem a reação de amplificação dos ácidos nucleicos podendo causar resultados inválidos. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenômenos de inibição por parte dos medicamentos antivirais, antibióticos, quimioterápicos ou imunossupressores. Os resultados obtidos com este produto dependem da correta coleta, transporte, armazenamento e preparação das amostras; para evitar resultados incorretos, é necessário, portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extração dos ácidos nucleicos. Devido a sua alta sensibilidade analítica, o método de amplificação em tempo real dos ácidos nucleicos utilizados neste produto está sujeito à contaminação por amostras clínicas positivas para DNA de MTB, controles positivos e, até mesmo, produtos da reação de amplificação. As contaminações levam a resultados falsos positivos. O produto foi desenvolvido de forma a limitar as contaminações; mesmo assim estes fenômenos podem ser evitados somente com uma boa prática de laboratório e seguindo escrupulosamente as instruções fornecidas nestas instruções. Este produto requer pessoal instruído no processamento de amostras biológicas potencialmente infecciosas e preparações químicas classificadas como para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o usuário ou outras pessoas. Este produto requer roupa de trabalho (EPI) e área de trabalho adequadas para a manipulação de amostras biológicas potencialmente infecciosas e de reagentes 10

11 classificados como perigosos, para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o usuário ou outras pessoas. Este produto requer pessoal instruído para técnicas de biologia molecular como extração, amplificação e detecção de ácidos nucleicos, para evitar resultados incorretos. É necessário possuir áreas separadas para a extração/preparação das reações de amplificação e para a amplificação/detecção de produtos de amplificação para prevenir resultados falso positivo. Este produto requer o uso de roupas de trabalho (EPI) e instrumentos destinados à extração/preparação das reações de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de MTB não foi detectado no DNA extraído da amostra, mas ela pode conter DNA de MTB a um título inferior ao limite de detecção do produto (veja capítulo Características de Desempenho), neste caso o resultado será um falso negativo. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, existe um risco latente de obter resultados não válidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco residual não pode ser eliminado ou reduzido. Em situações particulares como diagnósticos de urgência, o risco residual pode contribuir a decisões incorretas com consequências graves para o paciente. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Controles de Amplificação É necessário confirmar cada sessão de amplificação com reação de controle negativo e uma reação de controle positivo. Para o controle negativo, utilizar água bidestilada estéril (não fornecida com o produto) adicionada à reação no lugar do DNA extraído da amostra. Para o controle positivo, utilizar o produto MTB Controle Positivo. Controles de Qualidade É recomendado validar todo o procedimento de análise para cada sessão de extração e amplificação pelo processamento de uma amostra negativa e uma positiva que já foram testadas ou utilizar material de referência de calibração. VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES DEMOGRÁFICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, ESTATÍSTICOS, DESEJÁVEIS, TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão. 11

12 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO Sensibilidade Analítica: limite de detecção A sensibilidade analítica deste teste permite identificar a presença de aproximadamente 10 moléculas de DNA alvo nos 5 µl de DNA extraído e acrescentado à reação de amplificação. Em termos de limite de detecção, a sensibilidade analítica do ensaio foi testada usando uma cultura de M. tuberculosis. A bactéria foi diluída em solução fisiológica e contada através de um microscópio para determinar sua concentração. Diluições foram preparadas para obter 0, 1, 10, 50, 100 e 200 genomas da bactéria em 5 µl de DNA extraído adicionado à reação de amplificação. Essas diluições foram usadas em triplicatas para proceder com extração e amplificação pelo EliGene MTB Isolation Kit (Kit de extração de DNA EliGene) e MTB Q-PCR Alert Kit. M. tuberculosis foi detectado em todas as amostras contendo 10 ou mais genomas da bactéria. Complementando tudo isso, um DNA genômico humano com até 30ng por reação não afeta a sensibilidade do método. Os resultados finais do ensaio estão resumidos na tabela a seguir: Amostras N Positivos negativos 10 genomas de M. tuberculosis Negativo Correto Correto Sensibilidade diagnóstica: eficiência de detecção em diferentes subtipos A sensibilidade diagnóstica do teste, que é a eficiência de detecção e quantificação nos diversos genótipos /subtipos, foi avaliada por comparação de sequências com banco de dados de nucleotídeos. As regiões escolhidas para hibridização dos primers e da sonda fluorescente foram comparadas pela análise de alinhamento com as sequências disponíveis no banco de dados para a região genômica IS6110 do M. tuberculosis. A análise de alinhamento mostrou a conservação das regiões escolhidas e a ausência de mutações significantes em diferentes subtipos. Sensibilidade diagnóstica: amostras positivas A sensibilidade diagnóstica do ensaio, com a confirmação de amostras clínicas positivas, foi avaliada pela análise de 53 amostras clínicas em dois painéis que eram positivos para o DNA de Mycobacterium spp. E foi igual a 96.2%. O primeiro painel de material de referência positiva para Mycobacterium spp. inclui seis amostras de escarros e três amostras de exsudatos testados por ensaios de cultura clássicos e uma amostra de urina pelo ensaio microscópio de ART. Cada amostra foi usada para executar o procedimento de análise completa, da extração a amplificação, pelo EliGene MTB Isolation Kit e MTB Q-PCR Alert Kit. Os resultados finais do ensaio estão resumidos na tabela a seguir: Amostras N Positivo Negativo Inválido Amostras positivas de escarro para Mycobacterium spp Amostras positivas de exsudato para Mycobacterium spp Amostras positivas de urina para Mycobacterium spp *Foi descoberto que as duas amostras com resultados discordantes estavam infectadas pelo M. avium e M. xenopi, duas micobactérias que não estão no complexo M. 12

13 tuberculosis e não são detectadas por esse kit. O segundo painel de material de referência positiva para M. tuberculosis inclui 41 amostras de escarros testadas pelos produtos de diagnóstico AMPLICOR e o instrumento COBAS AMPLICOR (Roche Molecular Systems, Branchburg, N.J. USA). Cada amostra foi testada efetuando o procedimento completo de analise, extração e amplificação, pelo EliGene MTB Isolation Kit e MTB Q-PCR Alert Kit. Os resultados finais do ensaio estão resumidos na tabela a seguir: Amostras N Positivo Negativo Inválido Escarros positivos para M. tuberculosis Especificidade analítica: marcadores com potencial de reação cruzada A especificidade analítica dos testes, como a reatividade cruzada com outros marcadores, foi avaliada pela comparação de sequências de banco de dados de nucleotídeos. As regiões escolhidas para a hibridização dos primers e a sonda fluorescente foi comparada pela análise de alinhamento com sequências disponíveis em banco de dados de organismos diferentes do M. tuberculosis. A análise de alinhamento mostrou homologia significante somente com a sequência de M.bovis. M. bovis é o agente etiológico de tuberculose em gado e em outros animais e raramente em humanos. Em termos de ausência de reação cruzada com outros marcadores, a sensibilidade analítica do ensaio foi avaliada pela análise de amostra de DNA de diferentes organismos. A especificidade analítica do ensaio foi testada usando-se materiais de referencia de 50 diferentes amostras de DNA genômico humano e amostras de DNA de M. kansasii, M. xenopi, M. avium, M. marinum, M. gordonai, M. peregrinum, M. malmoense, M. fortuitum, HBV, EBV, CMV, HSV1, HSV2, VZV, C. trachomatis, E. coli, A. niger e C. albicans. Cada amostra foi usada para a amplificação com MTB Q-PCR Alert kit. O resultado do ensaio foi negativo para todas as amostras. Especificidade diagnóstica: amostras negativas A especificidade diagnóstica do teste, confirmando amostras clínicas negativas, foi verificada analisando 507 amostras clínicas que eram negativas para DNA de M. tuberculosis. Para o teste de especificidade diagnóstica, 507 amostras clínicas (incluindo escarro, exsudatos e urina) onde foram usados materiais de referência negativos para Mycobacterium spp. Estas amostras foram testadas ensaio de cultura clássica. Cada amostra foi usada para efetuar um procedimento completo de análise, extração e amplificação com EliGene MTB Isolation Kit e MTB Q-PCR Alert Kit. Os resultados são referidos na tabela seguinte: Amostras N Positivo Negativo Inválido 507 amostras clínicas negativas para DNA de Mycobacterium spp Juntamente com as 26 amostras inibidas, havia 9 amostras de urina. Os estudos de diluição, descrevendo as modificações nos resultados produzidos pela diluição da matriz: Não é o caso. Diluições não são recomendadas. 13

14 Os efeitos da matriz decorrentes da presença de proteínas, lipídios, bilirrubina, produtos da hemólise e outros interferentes, com recomendações para minimizar a ação destes interferentes, quando possível: Não aplicável. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BANNISTER B. A., BEGG N. T., GILLESPIE S. H., Infectious Disease. Blackwell Science, 2th Ed., 2000 IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Website: CNPJ: / INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. C.so Torino, 89/d Buttigliera Alta (TO) - Itália REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: X Mauricio Cichon Laboratório Assinado por: Maurício Cichon Aprovação: 20/12/

15 WORKSHEET A B C D E F G H