PADRONIZAÇÃO DE ENSAIO DE PCR EM TEMPO REAL EM FORMATO MULTIPLEX APLICADO AO DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES POR HTLV-1 E HTLV-2

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1 PADRONIZAÇÃO DE ENSAIO DE PCR EM TEMPO REAL EM FORMATO MULTIPLEX APLICADO AO DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES POR HTLV-1 E HTLV-2 Gonçalves MG 1, Fukasawa LO 1, Alencar WK 2, Caterino-de-Araujo A 1 1 Instituto Adolfo Lutz, 2 Centro de Referência em DST/Aids de São Paulo, SP., Brasil. Suporte: MS/SVS/DDAHV # BRAK57; DECIT/CNPq/FAPESP/SES-SPPPSUS # 12/ ; FAPESP IC # 13/ ; FAPESP TT3 # 2013/ ; CNPq PD # /

2 Introdução: O diagnóstico laboratorial do HTLV-1 e HTLV-2 se baseia na pesquisa de anticorpos específicos no soro por meio de ensaios imunoenzimáticos (triagem sorológica), seguida de testes confirmatórios como o western blotting (WB). Entretanto, o WB apresenta alto custo, além de gerar resultados não conclusivos em mais de 30% das amostras testadas. Em vista destas limitações, testes moleculares têm sido propostos para o diagnóstico confirmatório e discriminatório do HTLV-1/2, permitindo a confirmação de resultados positivos e esclarecimento de casos indeterminados/inconclusivos da triagem sorológica. Em estudo anterior foram padronizados ensaios de PCR em tempo real (qpcr) em formato individual para identificação dos segmentos pol do genoma proviral de HTLV-1 e HTLV-2 e o gene da albumina humana como controle endógeno, os quais se mostraram úteis na elucidação de amostras com perfil indeterminado no WB. Objetivo: No presente trabalho, padronizamos um ensaio de qpcr em formato triplex para detecção simultânea de HTLV-1, HTLV-2 e albumina humana com o objetivo de reduzir custos, tempo de trabalho e o uso do material extraído.

3 Material e Métodos: Os ensaios triplex foram realizados no sistema de PCR em tempo real LightCycler 480II (Roche) empregando-se sondas de hidrólise. FAM HTLV-1 CY5 HTLV-2 HEX albumina Parâmetros testados: concentração dos primers (variando-se entre 300 e 900 nm) e de sondas (100 a 500 nm); diferentes reagentes (TaqMan master mix universal-applied Biosystems-ABI/Life; LightCycler 480 Probes Master-Roche e LuminoCt-Sigma). As análises foram feitas comparando-se os perfis de emissão de fluorescência, dos níveis de baseline e das curvas de amplificação das reações nos dois formatos, triplex e single, onde todas as sondas foram marcadas com FAM.

4 Resultados: Nos ensaios triplex, todas as alterações nas concentrações de primers e/ou sondas empregando-se o reagente da ABI resultaram em reações com baixa eficiência, com maior ruído de baseline e menor índice de fluorescência quando comparadas com as reações single (Figura 1A a 1F). Já com o reagente da Roche que é específico para ensaios multiplex, as reações de qpcr tanto no formato single como multiplex apresentaram resultados esperados para uma reação otimizada, com menor ruído de baseline e curvas de amplificação com perfil exponencial (Figuras 1G a 1I). Empregando-se o reagente da Sigma obtivemos resultados semelhantes aos apresentados com o uso do reagente da Roche. Figura 1. Curvas de amplificação obtidas nas reações de PCR em tempo real (qpcr) nos formatos single e triplex para detecção de HTLV-1 (A e D), HTLV-2 (B e E) e albumina humana (C e F) empregando-se master mix da Applied Biosystems/Life. Curvas de amplificação obtidas nas reações de PCR em tempo real (qpcr) no formato triplex para detecção de HTLV-1 (G), HTLV-2 (H) e albumina humana (I) empregando-se master mix da A da Roche

5 Discussão e Conclusões: Nossos dados demonstraram que fatores intrínsecos dos reagentes como concentração de magnésio ou o tipo de DNA polimerase empregada influenciaram na eficiência das reações de qpcr no formato multiplex Ensaios complementares serão realizados para avaliar a eficiência das reações nos formatos single e multiplex, limite mínimo de detecção, reprodutibilidade intra e inter-ensaio, entre outros testes necessários para a validação do ensaio. A padronização de um ensaio de qpcr multiplex para o diagnóstico de HTLV pode ser útil em situações onde há limitação de material biológico, além de reduzir custos e tempo de trabalho.

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