Antes da descoberta dos sirnas oligonucleotídeos antisenso (ASO) eram usados para silenciar genes

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1 Antes da descoberta dos sirnas oligonucleotídeos antisenso (ASO) eram usados para silenciar genes Zamecnik PC and Stephenson ML, 1978: oligonucleotídeos como agentes antisenso para inibir replicação viral.

2 1 Oligonucleotídeo antisenso (tipicamente 20 nts) (não há um mecanismo biológico de reconhecimento da fita antisenso) Mecanismo de silenciamento: Clivagem RNase H CAP AAAA mrna DNA ou Ribossomo Bloqueio da tradução CAP DNA AAAA mrna

3 O que precisamos para usar RNAi? A seqüência de uma porção do gene alvo Sintetizar a molécula de dsrna correspondente Introduzir o RNA na célula ou organismo Atualmente, sirna é o instrumento mais poderoso para estudos de genética reversa.

4 Como pode ser produzido o sirna? - Síntese química:. dsrna com 21 nt, sendo 2 nt 3 overhang - Transcrição in vitro a partir de DNA seguida de digestão enzimática e purificação. - Em vetor de expressão (plasmídeo ou vírus): Transcrição e processamento são feitos dentro das células

5 Regras empíricas para desenho de sirnas (Tuschl) sirns devem ter 21-nt senso e 21-nt anti-senso, pareados de tal modo que resulte em 2-nt 3 dtdt overhang A região alvo é selecionada no cdna a partir de 50 a 100 nt à frente do sítio de início de transcrição; 3 UTR também pode ser um bom alvo. Os nucleotídeos 1-19 do sirna senso correspondem à posição 3-21 dos 23 nt do alvo. O alvo selecionado não deve ter mais que 50% de GC sirna não deve ser complementar a outros mrnas.

6 Propriedades termodinâmicas do sirna: A estabilidade relativa das extremidades do sirna é um parâmetro essencial na escolha da fita que será incorporada no complexo RISC Kurreck J (2.006)

7 A variabilidade na eficácia do sirna pode ser devida à variabilidade na escolha da fita guia e à inacessibilidade do alvo: A estrutura da fita guia do sirna também é importante Kurreck J (2.006)

8 Estruturas secundárias no mrna ou interação com outras proteínas também podem impedir a interação do complexo RISC com o mrna alvo. Previsão de estruturas secundárias no mrna:

9 Experiência acumulada com oligos antisense (ASO) foi muito útil para sirnas Modificações para aumentar a estabilidade: Meia-vida em humanos: ~ 9 10 h (não modificado: 1 h) Forma pareamento usual Watson-Crick

10 Menos tóxicos e com afinidade levemente maior que PS-ASO

11 Ativa RNase H Terceira Geração de ASO A maioria não ativa RNase H

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13 sirna sintéticos

14 Transcrição in vitro do dsrna

15 Transcrição in vitro do dsrna

16 Transcrição in vitro do shrna

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18 Uso de vetores para expressão do shrna

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20 Yang Shi (PNAS 99: ,2002), Construiu um vetor para expressão de shrna: plasmídeo Blue Script modificado pela inserção do promotor U6, que controla a transcrição do sirna U6 Término de transcrição TTTTT pbs/u6 A seqüência codificante para sintetizar o sirna é escolhida dentro da seqüência codificante do gene que se quer silenciar.

21 Kim DH e Rossi JJ, 2007 Promotores para RNA polimerase II: expressão condicional em tempo e local específicos

22 Eletroporação Lipofecção

23 Transfecção em células que fazem o empacotamento Retrovirus

24 Vetores Virais Kim DH e Rossi JJ, 2007

25 Quando usar sirna sintético? Duração necessária do silenciamento não passa de 5 a 7 dias. Efeito adequado em 2 a 3 dias. Silenciamento mais longo: expressar shrna Silenciamento de 1 semana ou menos: Células imortalizadas aderentes à placa de cultura: - sirna sintetizado quimicamente - Transfecção Cultura primária e células em suspensão: - sirna sintético - Eletroporação Células muito diferenciadas: - Vetor viral expressando shrna - Infecção

26 Silenciamento de 1 semana ou mais: Células imortalizadas aderentes: - Vetor (plasmídeo) expressando shrna com gene de resistência a antibiótico para deleção de expressão estável - Transfecção Cultura primária, células em suspensão ou muito diferenciadas: - Vetor Viral - Infecção

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28 Direcionamento do sirna para a célula alvo Métodos não seletivos: - sirna modificados conjugados a colesterol - partículas lipossomais (Stable Nucleic Acids Lipid Particles SNALPs) Kim DH e Rossi JJ, 2007

29 Métodos seletivos - sirnas ligados a haptâmeros reconhecidos receptores em células específicas Kim DH e Rossi JJ, 2007

30 Métodos seletivos - sirnas ligados a fragmento da cadeia pesada de anticorpos (Fab) - Nanopartículas Kim DH e Rossi JJ, 2007

31 Detecção do silenciamento: - Análise da quantidade de mrna específico (24 a 48 horas) RT-PCR em tempo real - Análise da presença da proteína (48 a 72 h, dependendo da meia vida da proteína) Western blot, imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunoensaio

32 Alguns problemas identificados: O sirna pode não ser seletivo e pode ligar-se a outros mrna na célula (off-target effects). - Resposta imune (ativação de Toll like receptors TRLs) - O alto nível de expressão de shrna pode competir pela interação com os complexos que processam mirna endógenos. - shrna transcritos pela RNA polimerase III tem trifosfato na extremidade 5 e esse pode ativar RIG (retinoic acid-inducible protein). Isso pode ser evitado se é usada RNA polimerase II.

33 Controles experimentais ao usar sirna: - Células não transfectadas - Células transfectadas com sirna sem alvo - Controles positivos: sirnas para genes constitutivamente expressos sirna já testado para gene que participa da via metabólica analisada Testar mais de um sirna para o gene alvo (em geral 3) Não é conveniente usar pool de sirnas

34 Outros controle: Eficiência de incorporação do sirna pela célula sirna marcado - Cy3, FAM Ao quantificar o mrna e a proteína na célula tratada com sirna, avaliar também um gene de expressão constitutiva (GAPDH, b-actina...) Normalizar a quantidade de proteína pelo número de células viáveis. O processo não deve reduzir a viabilidade celular em mais que 30%. sirna é considerado eficiente se reduz o mrna em no mínimo 70% e a proteína em no mínimo 50%

35 Kim DH e Rossi JJ, 2007

36 mirnas

37 Pelo menos 1/3 dos genes humanos parecem ser alvos de regulação por mirnas. A combinação única de mirnas em cada tipo de célula determina o uso dos milhares de mrnas. Identificação de alvos: Alvos de mirna tendem a ser preservados entre as espécies Friedman RC et al, 2009 Xiao F at al, 2009

38 Método mais usado para identificar alvos de mirnas:. Vetores contendo gene repórter (Ex. Luciferase). O 3 UTR do suposto mrna alvo é clonado na frente do gene repórter. Vetor recombinante é transfectado na célula de interesse com ou sem o mirna. Localização da sequência alvo no 3 UTR (MRE - mir responsive element) através de mutação sítio-dirigida.. Quantificação da Luciferase. Quantificação do mrna alvo por RT-PCR Karginov FV et al, 2007

39 . Expressão do mirna (pre ou pri-mirna em vetores) e análise dos mrnas. Imunoprecipitação da Ago2 carregada com mirnas Purificação do mirna Amplificação com oligo- específico (PCR) Marcação fluorescente Hibridização de micro-array Para identificação de alvos, o mirna pode ser também "down regulated" utilizando oligonucleotídeos complementares quimicamente modificados (antagomir) ou sirna dirigido ao mirna.

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47 Extração de pequenos RNAs - (Ambion)

48 RNAs pequenos

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50 PCR com primer com estrutura hairpin para detectar e quantificar mirnas

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