CLONAGEM DE DNA. CLONAGEM: é multiplicar assexuadamente. Primeiros experimentos bem sucedidos de clonagem foram mostrados no início da década de 1970.

Transcrição

1 Clonagem de DNA

2 CLONAGEM DE DNA CLONAGEM: é multiplicar assexuadamente. Na Biologia Molecular, significa mais especificamente crescer uma colônia de bactérias a partir de uma célula única. Clonagem de genes é essencialmente o processo de amplificar seletivamente um gene particular, incorporando-o numa bactéria e clonando a bactéria. Primeiros experimentos bem sucedidos de clonagem foram mostrados no início da década de 1970.

3 Avanços conceituais e tecnológicos que contribuíram para a técnica de clonagem: Na década de 60: identificação de pequenas moléculas de DNA circular denominadas plasmídeos, que carregam genes de resistência bacteriana a antibióticos. No final da década de 60: descoberta e caracterização de endonucleases de restrição (Werner Arber, Hamilton Smith, Daniel Nathans; H. Smith e T. Kelly) 1967: Gellert - purificação da enzima DNA ligase 1972: Janet Mertz e Ronald Davis usaram DNA ligase para juntar fragmentos digeridos com Eco RI. 1972: o grupo de Paul Berg conseguiu inserir genes do bacteriofago l e genes de E. coli no genoma do virus SV40, construindo moléculas recombinantes

4 Por que clonar? Sequenciamento de DNA Separar fragmentos de DNA em clones independentes Estudar a transcrição e a tradução do gene Fazer estudos de expressão funcional Sintetizar proteínas para produção de anticorpos Sintetizar proteínas para uso terapêutico etc, etc

5 Para clonar é necessário um VETOR Um vetor de clonagem é uma molécula de DNA que tem 3 características fundamentais: É capaz de replicar independentemente do cromossomo da célula hospedeira. Organismos contendo o vetor devem poder se desenvolver preferencialmente em um dado meio, porque o vetor confere ao organismo alguma propriedade física ou química, ou ambas, que lhe permite este crescimento preferencial. O vetor aceita a inserção de DNA adicional em sua molécula de DNA.

6 Enzimas de restrição Enzimas de restrição foram primeiramente identificadas pela sua capacidade de restringir o crescimento de certas viroses em algumas linhagens de E. Coli. Por isso, foram denominadas enzimas de restrição. Essas enzimas fazem parte do mecanismo natural de defesa das bactérias contra a invasão de DNA estranho.

7 Sítios de reconhecimento para enzimas de restrição são curtas sequências reconhecidas e clivadas por várias endonucleases Bactérias com endonucleases de restrição também têm as enzimas correspondentes que metilam as bases específicas no sítio de reconhecimento, assim o seu próprio DNA fica protegido de autodigestão.

8 As enzimas de restrição catalizam a quebra da ligação fosfoéster (hidrólise) entre o oxigênio na posição 3 de uma base, e o fosfato ligado ao oxigênio na posição 5 da base seguinte. OH P P OH

9 Corte com extremidades coesivas stick ends 5 pendente ou 3 pendente Enzimas de restrição Corte com extremidades rombas blunt ends

10 A enzima se movimenta ao longo da major groove (difusão linear). Quando a seqüência específica é encontrada, há um notável rearranjo estrutural, tanto da enzima quanto do DNA. O DNA sofre uma dobra de cerca de 50 o no centro do sítio de reconhecimento. Mg 2+ é essencial para a hidrólise e entra no sítio catalítico apenas quando a seqüência alvo é encontrada. Eco RV endonuclease : 5 G - A - T - A - T - C 3 3 C - T - A - T - A - G 5

11 Fragmentos produzidos pela clivagem dos ~36 kb do DNA genômico de adenovirus 2 com Eco RI e Hind III GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA Exemplo de clivagem com enzima de restrição

12 Algumas endonucleases de restrição e seus sítios de reconhecimento As enzimas são nomeadas com as abreviações das linhagens de bactérias das quais foram isoladas

13 As duas enzimas da técnica de clonagem de DNA: - Enzimas de restrição Arber - ENZIMAS DE RESTRIÇÃO - DNA ligases 1967 Gellert - DNA LIGASE Extremidades pendentes menores que 15 nucleotídeos não fornecem pareamentos estáveis na temperatura de 37 o C. Para que os diferentes segmentos de DNA permaneçam juntos (o plasmídeo e o DNA que se quer clonar) é preciso restabelecer a ligação fosfoester com a LIGASE.

14 Os vetores de clonagem pertencem a duas classes gerais: - Plasmídeos - Fagos Tipos de vetores usados para clonagem

15 Clonagem de DNA usando plasmídeos como vetores

16 Plasmídeos Pequenas moléculas circulares de DNA dupla fita, não incorporadas ao genoma das bactéria São formas autoreplicativas de DNA Todas as enzimas necessárias para a replicação de um Plasmídeo são produzidas pela bactéria hospedeira, embora proteínas codificadas pelo plasmídeo auxiliem na regulação de sua replicação.

17 Plasmídeos utilizados para clonagem foram construídos a partir de fragmentos do plasmídeo pbr-322 de E. coli. Todos os plasmídeos usados como vetor devem ter: REPLICATOR ou origem de replicação Marcador de seletividade Sítio de clonagem

18 Origem de replicação (replicator, replicon): é uma sequëncia específica do plasmídeo, com cerca de pb, na qual tem início a replicação do DNA. Neste local há um conjunto de elementos regulatórios envolvidos no controle do número de cópias do plasmídeo que serão feitas numa única bactéria. No pbr322: replicon pmb1 - há produção de 15 a 20 cópias/célula No pblue Script: forma mutada do mesmo replicon há produção de 500 a 700 cópias/célula

19 MARCADOR DE SELETIVIDADE O marcador de seletividade permite a identificação da bactéria que recebeu o plasmídeo. No vetor ao lado, são genes que codificam proteínas que degradam antibióticos. Amp: betalactamase que degrada ampicilina

20 SÍTIO DE CLONAGEM O sítio de clonagem consiste de uma seqüência de nucleotídeos que corresponde a sítios de interação com enzimas de restrição, e que é adicionada ao vetor por engenharia genética. Para clonar, escolhemos uma enzima que corte em um ou dois destes locais. Seqüência polylinker ou multiple-cloning-site (MCS) que inclui uma cópia do sítio de reconhecimento para cada uma das 10 enzimas indicadas Plasmídeo UC19

21 Ligação de fragmentos de restrição com extremidades coesivas As ligases usadas no laboratório: T4 DNA ligase: produzida pelo bacteriofago T4 liga tanto extremidades coesivas, como extremidades cegas. DNA ligase de E. Coli: liga apenas extremidades coesivas

22 Digestão do vetor para clonagem Se a ligação no vetor é feita após a digestão com enzimas de restrição que produzem extremidades cegas (blunt ends), ou se o vetor foi linearizado com apenas uma endonuclease de restrição, é necessário desfosforilar a extremidade 5 -P do vetor, para evitar auto-ligação. Enzima: Fosfatases Removem grupos fosfato da extremidade 5 das moleculas de DNA, substituindo-os por -OH.

23 Vetor cortado com uma única enzima que corta no ponto a : a b O vetor ficará com as extremidades (a) e (a ) que são compatíveis. Ao ser adicionada a ligase, o vetor será novamente fechado, sem inserto. Para que isso não ocorra, é preciso usar fosfatase, que remove o P da extremidade 5

24 a b Se duas enzimas distintas forem usadas para abrir o vetor, as extremidades se tornam incompatíveis. Ele não é fechado pela ligase. O DNA a ser inserido deve ser cortado com as mesmas duas enzimas, para ter extremidades compatíveis com o vetor.

25 Que tipo de fragmento de DNA podemos inserir em um vetor: O DNA a ser inserido tem que ser dupla-fita. Enzimas de restrição só cortam DNA dupla-fita. O fragmento de DNA pode ser : cdnas sintetizados as partir de mrnas Produto de digestão de DNA genômico com endonucleases de restrição Produto de PCR DNA dupla fita de qualquer origem

26 Os fragmentos de DNA a serem clonados são cortados com as mesmas enzimas utilizadas para linearizar (abrir) o vetor

27 Após a obtenção do plasmídeo recombinante contendo a sequência de interesse, o próximo passo é colocá-lo na bactéria. Esse processo é denominado transformação. A transformação é um processo ineficiente, porém eficiente o bastante para nossos propósitos. Tipicamente, de 10 9 células em contato com 1 ug de plasmídeo (~ moléculas), apenas aprox receberão o plasmídeo (1: 10 6 ) Como a probabilidade de uma célula captar um plasmídeo é baixa, a probabilidade de uma célula captar dois ou mais é extremamente baixa.

28 Inserção do plasmídeo em bactérias: Choque térmico (bactérias tornadas competentes ) Eletroporação (bactérias normais, em meio de baixa força iônica) Seleção das bactérias transformantes (marcador de seletividade) resistência a antibiótico Seleção das bactérias transformadas com plasmídeos recombinantes: alfa complementação do gene da betagalactosidase (colônias azuis ou brancas)

29 Transformação das bactérias

30 Ao transformar as bactérias, cada uma receberá um único plasmídeo. Cada clone de bactérias terá um único plasmídeo. Assim os fragmentos que antes estavam misturados, agora estão individualizados

31 Repressão removida por IPTG Lac repressor O fragmento a da betagalactosidase (LacZ ) é codificada pelo plasmídeo. A inserção do DNA a ser clonado interrompe a sequência do LacZ. puc plasmid - genérico

32 Fragmento Ω da betalactamase é produzido pela bactéria α-complementação lacz inteiro (α) + Ω: Betagalactosidase ativa Cliva X-gal Colônias azuis Laz segmentado Betagalactosidase Ω inativa Colônias brancas

33 Purificação do plasmídeo Genomic Relaxed Supercoiled

34 Quando usar plasmídeos: São utilizados para clonagem de fragmentos relativamente pequenos (no máximo 20 kb) São de fácil manuseio Existem vários tipos de plasmídeos comercialmente disponíveis, cada um com vantagens e aplicações específicas: vetores para síntese de RNA e proteínas (vetores de expressão) vetores com genes repórteres plasmídeos para produção de proteínas de fusão etc

35 Vetores plasmídeos para transfecção de células eucariotos: São vetores usados para expressar genes clonados em células animais ou vegetais. Estes vetores possibilitam a expressão de genes tanto em bactérias como em eucariotos. - Para replicação em bactérias, carregam um replicon (origem de replicação) bacteriano e um gene de resistência a antibiótico. - Para propagação em eucariota, carregam um promotor viral e um enhancer localizados à 5 da região codificante do gene a ser clonado e um sítio de poliadenilação à 3 do gene. Alguns também incluem um intron, antes ou depois da região codificante.

36 No primeiro vetor eucariota utilizado, estes elementos foram provenientes do virus SV40. Uma vez inserido na célula, a proteína codificada no plasmídeo passa a ser expressa após algumas horas. Neste estágio, a maioria do DNA do plasmídeo inserido na célula é extracromossomal. Após vários dias, algumas moléculas de plasmídeo se integram no genoma de raras células.

37 Vetores de expressão

38 Vetores de expressão típicos têm: Promotores que dirigem a síntese de grande quantidade de mrna do gene que se quer expressar Sequências que permitam a replicação autônoma em bactéria (origem de replicação) Seqüências que codificam traços genéticos que possibilitam reconhecer as células que contêm o vetor Seqüências que aumentam a eficiência da tradução do RNA

39 Expressão de proteínas recombinantes: Expressão em E. coli Vantagem: simplicidade e baixo custo Expressão em células eucariotas Vantagens: quase sempre as proteínas são expressas no compartimento subcelular correto e corretamente processadas. Desvantagem: difícil produzir em larga escala (células de mamíferos, por ex.) Produção em levedura é eficiente

40 Expressão da proteína recombinante em procariotas: Clonar o cdna a partir de mrna processado, pois é preciso lembrar que bactérias não removem introns. Retirar também as regiões 5 UTR e 3 UTR. Adicionar a seqüência Shine Dalgarno (AGGAGG, 5 a 12 bases antes do ATG), para expressão em procariota. Esta seqüência contribui para localização da metionina inicial. ATG inicial que codifica uma formil-metionina em bactérias, pode eventualmente ser removida, apenas se o segundo amino ácido for um amino ácido com cadeia lateral pequena. Leucina deve ser evitada nesta posição. STOP codon

41 A seqüência de Shine-Dalgarno é favorece a atividade ótima dos ribossomos Expressão em procariota (E. coli)

42 Codon usage: A diferença entre o uso do código ( codon usage ) pode ser um motivo para expressão ineficiente em procariotas. Codons que são muito raramente usados em E. coli correspondem a poucas moléculas do trna específico. Isso torna a síntese de uma proteína eucariota muito ineficiente em E.coli. Solução: Fazer co-expressão dos trnas raros Modificar o codon, para um codon mais comum em E.coli, preservando o amino ácido.

43 Promotor: A transcrição do gene alvo em procariotas é controlada por dois sistemas básicos: tac promoter, reconhecido pela RNA polimerase de E. coli T7 promoter de bacteriofago, reconhecido pela T7 RNA polimerase (este tem a vantagem de propiciar uma expressão muito baixa na ausência de indução). Inicialmente, o vetor com o cdna a ser expresso é propagado numa bactéria que não tem o gene da T7 RNA polimerase. O plasmídeo recombinante é em seguida purificado e sequenciado. Em seguida, o plasmídeo já estabelecido é transferido para uma linhagem bacteriana que expresse o gene da T7 RNA polimerase.

44 Os sistemas indutíveis são os mais adequados para expressão em E. coli porque altos níveis de proteína heteróloga podem ser letais para a bactéria. Os vetores ideais para expressão em E. coli devem ter: - Um promotor indutível - O sinal de término de transcrição - Um enhancer opcional - Um stop codon - Gene de resistência a antibiótico - Origem de replicação que determina o número de cópias do plasmídeo na célula.

45 Sistema de indução em E. coli: Lac repressor / Análogo da lactose (IPTG)

46 Proteínas expressas em E. coli frequentemente formam agregados protéicos, denominados corpos de inclusão. Isso não costuma ser problema se o objetivo final é produzir proteínas para produção de anticorpos. No entanto, é problema se o que se deseja é uma análise funcional da proteína. Uma possível solução é expressar a proteína como proteína de fusão. Proteínas de fusão costumam ser mais estáveis que as proteínas nativas em E. coli. Além disso, é mais fácil purificar uma proteína de fusão. As fusões mais comuns são com: - GST (glutationa S transferase) e - segmento polihistidínico (tag de histidina)

47 Vetores para expressão de proteínas de fusão Fusão com Glutationa S-transferase GST 26kd GST sua proteína Clivagem com trombina ou fator Xa Controle do P tac A proteína de fusão é purificada em coluna contendo glutationa.

48 A proteína de fusão, sua proteína de interesse + GST, pode ser facilmente purificada em coluna contendo glutationa, o substrato da enzima GST. GST pode ser separada de sua proteína de interesse por digestão enzimática. Na região entre uma proteína e outra há sítio de clivagem para a trombina ou outra protease. O sistema é muito útil para isolar proteínas da célula que interagem com sua proteína de interesse.

49 Expressão da proteína nativa em eucariotos: Para expressão de proteínas em eucariotos, é necessário adicionar imediatamente antes da região codificante da proteínas: Seqüência Kozac (-- GCCACC ATG G -), para expressão em eucariota Além disso, deve ser adicionado: ATG inicial STOP codon

50 Seqüência de Kozac: a introdução da sequência de Kozac facilita a identificação do ATG inicial pelos ribossomas em eucariotas Expressão em eucariotas

51 Os vetores para expressão em eucariotos, possuem uma origem de replicação bacteriana e um gene de resistência a antibiótico para propagação inicial em bactérias. Para propagação em eucarioto, carregam um promotor e um enhancer localizados à 5 da região codificante do gene a ser clonado e um sítio de poliadenilação à 3 do gene. Alguns também incluem um intron, antes ou depois da região codificante. Os primeiros vetores para expressão em eucarioto tinham um promotor e um enhancer do virus SV40 Muitos vetores têm um promotor do CMV.

52 Um plasmídeo para expressão de proteína recombinante em eucarioto: P CMV : enhancer-promoter do Cytomegalovirus, que induz uma transcrição constitutiva e abundante do gene clonado sob seu controle em eucariotos. BGH pa: Sinal de poliadenilação do gene Bovine Growth Hormone (BGH) f1 ori: Origem de replicação para obter fitas únicas, sense. SV40 ori: Origem para replicação epissomal em célula eucariota. puc ori: Origem para replicação em bactéria Resistência a Neomycin ou Zeocin: para seleção de células eucariotas. Resistência a Ampicilina: para seleção de bactérias (E. coli)

53 Transfecção de células eucariotas

54 Métodos de Transfecção: Transfecção por métodos bioquímicos Precipitação de fosfato de cálcio Lipídeos catiônicos Transfecção por métodos físicos Microinjeção com partículas de ouro ou tungstênio Eletroporação Transfecção mediada por infecção viral

55 Eletroporação Lipofecção

56 Microinjeção Indicado para células vegetais

57 Transfecção transiente e estável: Transiente: O DNA recombinante é introduzido na linhagem celular receptora com o objetivo de obter uma expressão temporária porém elevada do gene de interesse. A proteína codificada pelo cdna transfectado é detectada na célula após algumas horas. Neste estágio, a maioria dos plasmídeos recombinantes é extracromossomal, mas após vários dias algumas moléculas do vetor se integram no genoma da célula. Estável: Usada para estabelecer linhagens celulares nas quais o gene transfectado está inserido no DNA cromossomal, onde ele comanda a síntese de quantidades moderadas da proteína alvo. O isolamento dos raros transformantes estáveis de um background de células não infectadas é facilitado pelo uso de marcadores genéticos para seleção. (Resistência a Neomycin, Zeocin, Hygromycin)

58 Retrovirus: o genoma é um RNA fita única. É convertido em DNA dupla fita dentro da célula infectada. O DNA dupla fita se integra no cromossomo da célula hospedeira como genoma proviral. O provirus continua a transcrever seu genoma inteiro, o qual codifica todas as proteínas necessárias para fazer novos virions. LTR genes virais gag pol env LTR LTR tandem long terminal repeats, importantes para mediar a integração do provirus e para regular a transcrição.

59 O retrovirus para expressão de proteínas clonadas não tem seus próprios genes preservados Células de empacotamento produzem partículas virais com RNA viral contendo o gene de interesse As células infectadas não produzem partículas virais

60 Técnica de clonagem para estudo de promotores

61 Vários segmentos do promotor são inseridos em vetor com gene repórter +1 A transcrição do gene repórter será comandada pelos diferentes segmentos do promotor em análise A proteína produzida a partir do mrna é quantificada: quanto mais eficiente for o segmento do promotor, maior a quantidade de proteína produzida

62 São removidos promotor/enhancer que controlam a transcrição do gene da Luciferase. Obtem-se o vetor abaixo para estudo de promotores: No sítio de clonagem é introduzido o fragmento de DNA correspondente ao promotor do gene que se quer estudar. O vetor recombinante é transfectado para células eucariotas que normalmente expressam a proteína de interesse. Gene que codifica Luciferase, que é a proteína repórter

63 Medida da atividade de luciferase

64 Técnica de clonagem para identificação de proteínas que interagem umas com as outras no interior da célula: Two-hybrid system

65 Estes experimentos são realizados em leveduras. A linhagem de levedura é transformada com o plasmídeo recombinante que produz a proteínaisca fusionada com o módulo protéico que interage com o DNA na região do promotor. É construída uma biblioteca do tecido no qual se quer procurar proteínas (presa) que interagem com a proteína-isca. Esta biblioteca é construída de modo que todos os genes são expressos na forma de proteína de fusão com o módulo de transativação do fator de transcrição, cujo módulo de interação com o DNA está ligado à proteína isca. Quando isca e presa interagem o gene repórter é ativado.

66 Um grande número de ORFs (open reading frames) têm sido interrompidas com a finalidade de obter informações sobre a função das proteínas que codificam. Knockout de genes de levedura

67 Knockout

68 Camundongo knockout

69 ZFN mrna targeted

70 Detecção das células mutadas

71 Camundongo transgênico