I Curso de Verão em Oncologia Experimental Cursos Práticos

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1 I Curso de Verão em Oncologia Experimental Cursos Práticos 1. Técnicas Experimentais para o Estudo da Expressão Gênica O curso terá como base o estudo da expressão gênica utilizando um fator de transcrição. Os alunos trabalharão com processos básicos de biologia molecular (cultura de bactérias e manipulação de DNA), na construção de um vetor plasmidial contendo o gene do fator de transcrição a ser estudado. Além disso, serão avaliadas a funcionalidade da construção e a atividade do fator com diversas técnicas de biologia celular: transfecção do vetor plasmidial em células eucarióticas; análise de expressão do gene clonado por citometria de fluxo e western blot; ativação e translocação nuclear do fator de transcrição por microscopia de fluorescência e análise da ativação transcricional do fator por ensaio de gene repórter (luciferase). Aulas teóricas serão ministradas para explicar os métodos utilizados e discutir as estratégias de abordagem usadas atualmente no estudo da expressão gênica. Pesquisador responsável: Dr. João Viola Pós-graduandos: André Cruz, Douglas Faget e Giuliana Mognol 2. Diagnóstico Molecular e Aconselhamento Genético no Câncer Hereditário O curso visa o aprendizado de metodologias utilizadas para a detecção de alterações genéticas relacionadas ao surgimento dos principais tipos de câncer hereditário. As abordagens utilizadas serão: extração de DNA de sangue periférico e de amostras tumorais; reação em cadeia da polimerase (PCR); eletroforese em gel de agarose; seqüenciamento de DNA; análise de seqüências através dos programas Chromas Pro e Sequencher e alinhamento de seqüências através do programa BLAST; e FISH (fluorescent in situ hybridization) em suspensões celulares feitas a partir de sangue periférico e em amostras tumorais. Pesquisador responsável: Dr. Héctor Seuanéz Pós-graduandos: Adriana Reis, Fernanda Aguiar e Raquel da Hora

2 3. Mecanismos Epigenéticos de Regulação Gênica Os mecanismos epigenéticos de regulação gênica têm sido estudados extensivamente nos últimos tempos, principalmente em tumores. Isso porque esses mecanismos podem levar à repressão de genes importantes, como os genes supressores de tumor e à ativação de oncogenes. Além disso, por serem reversíveis, as alterações epigenéticas têm sido apontadas como possível alvo para terapias anti-tumorais. O câncer de esôfago é um dos 10 tipos de tumor mais freqüentes e letais no Brasil e no mundo, porém existem poucos estudos sobre os mecanismos epigenéticos envolvidos no desenvolvimento desta neoplasia. Dentro deste contexto, nosso grupo vem estudando as alterações epigenéticas encontradas no carcinoma epidermóide de esôfago. O curso visa apresentar aos alunos metodologias que permitam avaliar os mecanismos epigenéticos envolvidos na regulação dos genes que participam do ciclo celular. As abordagens utilizadas serão: avaliação da expressão do mrna por PCR quatitativo dos genes p14 ARF e p16 INK4a ; tratamento com bissulfito de sódio e PCR; clonagem de produto de PCR; extração de DNA plasmidial e seqüenciamento de DNA. Pesquisador responsável: Dr. Luis Felipe Ribeiro Pós-graduandos: Sheila Coelho e Tatiana Simão 4. Abordagens Multidisciplinares no Estudo das Neoplasias Hematológicas Esse curso tem como objetivo principal apresentar uma visão integrada do campo de estudo das neoplasias hematológicas e suas principais abordagens experimentais. Serão discutidos conceitos sobre a hematopoiese normal e transformação maligna; neoplasias hematológicas mielóides e linfóides: marcadores celulares e moleculares; alterações genéticas nas leucemias (mutações, translocações, alterações do número de cópias, fatores epigenéticos, haploinsuficiência); fundamentos do tratamento e monitorização molecular das leucemias. Serão estudados a leucemia mielóide crônica e os linfomas B como modelos experimentais, com abordagens metodológicas que incluirão: extração e avaliação de ácidos nucléicos (RNA e DNA); estudo dos rearranjos de genes de imunoglobulina e receptor de células T como marcadores de clonalidade; estudo de translocações e mutações por reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciamento; quantificação da carga

3 tumoral (BCR-ABL) e de padrões de expressão gênica (BCL6 e ciclinas) por PCR em Tempo Real; citometria de fluxo; técnicas de imunolocalização celular de proteínas e RNA: imunohistoquímica e hibridização in situ (ISH), em preparações de tissue microarray. Pesquisador responsável: Dra. Rocio Hassan Pós-graduandos: Vanesa Scholl, Marta Nogueira, Mario Barros e Carolina Minnicelli 5. Terapia Gênica: Aplicações Práticas no Laboratório Esse curso tem como objetivo introduzir o aluno aos princípios da terapia gênica. As aulas teóricas irão abordar aspectos relevantes do histórico e da biologia básica da terapia gênica, assim como uma visão geral das aplicações práticas e clínicas desta metodologia. Nas aulas práticas, será enfatizado todo o processo de produção dos vetores retrovirais e lentivirais, as diferenças entre estes dois tipos de vírus e o processo de pseudotipagem dos vetores. Também serão avaliadas as diversas modalidades desta metodologia como a expressão de transgene, silenciamento gênico e o sistema indutível de expressão gênica. Para finalizar, serão realizados ensaios celulares demonstrando algumas aplicações práticas desta metodologia. Pesquisador responsável: Dr. Martin Bonamino Pós-graduandos: Ana Carolina Leal e Leonardo Chicaybam 6. Avaliação dos Mecanismos de Morte Celular Programada Induzida por Quimioterápicos Esse curso visa o aprendizado das principais metodologias utilizadas na avaliação da morte celular por apoptose, vias de sinalização relacionadas e a regulação do processo após indução de morte com quimioterápicos em linhagens tumorais. Linhagens celulares tumorais com diferentes características serão tratadas com quimioterápicos e o processo de morte celular induzido será caracterizado. Diversos aspectos da apoptose serão avaliados por citometria de fluxo. Será avaliada por western blot a ativação de caspases através da clivagem de substratos, bem como a morfologia nuclear das células apoptóticas por microscopia de fluorescência e a fragmentação internucleossomal de DNA em gel de agarose. A regulação do processo será estudada por PCR em tempo real de genes

4 envolvidos no processo de morte celular. Cada abordagem será explicada e comparada com outras técnicas disponíveis. Pesquisador responsável: Dra. Cinthya Sternberg Pós-graduandos: Érika Carvalho, João Laclette e Mauricio Caetano 7. Aplicação de Técnicas Celulares e Moleculares ao Estudo da Resistência a Múltiplas Drogas O curso tem como objetivo estudar os aspectos celulares e moleculares envolvidos com o fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR) nas neoplasias. Nas aulas práticas, os alunos farão cultura de linhagens leucêmicas e utilizarão amostras sanguíneas de indivíduos saudáveis, separadas por gradiente de densidade. A detecção da expressão e funcionalidade das proteínas MDR será analisada por citometria de fluxo e o envolvimento dessas proteínas com a resistência será avaliado através do ensaio de citotoxicidade MTT. A fim de verificar a expressão de proteínas relacionadas à resistência à apoptose, serão realizados imunocitoquímica e Western blot, no qual os alunos farão extração de proteínas e dosagem pelo Método Lowry. Pesquisador responsável: Dra. Raquel Maia Pós-graduandos: Ana Carolina Ferreira, Gabriela Nestal e Paloma Souza 8. Biomarcadores em câncer O curso visa o aprendizado de metodologias utilizadas na identificação e validação de biomarcadores envolvidos no diagnóstico e tratamento oncológico. Com esse objetivo, o curso apresentará uma visão geral sobre os biomarcadores, enfatizando seu conceito e importância no diagnóstico e tratamento do câncer, bem como a importância dos cuidados com a coleta, preparo e conservação das amostras. O curso contará com uma parte teórica inicial sobre técnicas utilizadas no rastreamento de biomarcadores, onde serão discutidas técnicas como microarray e proteômica. Após serão ministradas aulas práticas sobre as

5 alterações genéticas como biomarcadores, com foco na análise de instabilidade de microsatélite, aulas práticas sobre validação dos biomarcadores, com foco no PCR em tempo real e na imuno-histoquímica, como uma técnica utilizada no diagnóstico clínico. O curso contará ainda com uma aula teórica final onde será apresentada uma visão geral sobre os biomarcadores já estabelecidos e que se traduzem na prática clínica. Pesquisador responsável: Dr. Carlos Gil Pós-graduandos: Danielle Braggio, Luciene Schluckebier e Marcus Valadão