Reprogramação Celular. Pítia Ledur

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1 Reprogramação Celular Pítia Ledur

2 Reprogramação Celular O que é isso? ipsc = induced pluripotent stem cells Shinya Yamanaka

3 Reprogramação Celular O que é isso? ipsc = induced pluripotent stem cells Células totipotentes (tecidos embrionários e extraembrionários) Células pluripotentes (tecidos embrionários mas NÃO extraembrionários) Células tronco adultas = multipotentes ou unipotentes

4 Aplicações das células-tronco pluripotentes 1. Terapia Celular 2. Estudos do desenvolvimento 3. Modelagem de doenças 4. Testes toxicológicos e triagem de novos medicamentos

5 Reprogramação Celular O que é isso? Fatores de transcrição específicos

6 Aplicações das ipscs 1. Terapia Celular 2. Estudos do desenvolvimento 3. Modelagem de doenças 4. Testes toxicológicos e triagem de novos medicamento

7 Reprogramação Celular Aplicações e desafios

8 Reprogramação Celular Histórico SCNT = somatic cell nuclear transfer 1 Conclusões: - Genoma permanece totipotente - Modificações epigenéticas reversíveis

9 Reprogramação Celular Histórico Linhagens pluripotentes estabelecimento e cultivo 2

10 Linhagens pluripotentes estabelecimento e cultivo ECCs Somatic Cell Hybrid

11 Linhagens pluripotentes estabelecimento e cultivo - Oct4

12 Linhagens pluripotentes estabelecimento e cultivo Massa Celular Interna Conclusões: -Dominância de fatores de pluripotência -Células pluripotentes podem ser geradas experimentalmente Células Tronco Embrionárias (cultura in vitro)

13 Reprogramação Celular Histórico Fatores de transcrição linhagem-específicos 3 Conclusões: - Um tipo celular pode ser transformado em outro por meio da expressão ectópica de fatores de transcrição Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

14 E então... Como o Yamanaka realizou a reprogramação celular? Quais fatores ele utilizou, e como os escolheu?

15 Reprogramação Celular O que é isso?

16 Reprogramação Celular O que é isso?

17 24 genes candidatos relacionados à pluripotência e proliferação 1. Ecat1 2. Dppa5 (Esg1) 3. Fbxo15 4. Nanog 5. ERas 6. Dnmt3l 7. Ecat8 8. Gdf3 9. Sox15 10.Dppa4 11.Dppa2 12.Fthl Sall4 14. Oct3/4 (Pou5f1) 15. Sox2 16. Rex1 (Zfp42) 17. Utf1 18. Tcl1 19. Dppa3 (Stella) 20. Klf4 21. β-catenin 22. C-Myc 23. Stat3 24. Grb2

18

19 24 genes candidatos relacionados à pluripotência e proliferação

20 oct4 sox2 klf4 c-myc

21

22 Mas -Estas ipscs expressavam baixos níveis de diversos genes chave para a pluripotência quando comparadas com ESCs -Apresentavam desmetilação incompleta de promotores de genes reguladores de ESCs, como oct4 -Pareciam estar apenas PARCIALMENTE REPROGRAMADAS

23 Endogenous pluripotency genes show incomplete demethylation and reactivation

24 Reprogramação Celular O que é isso?

25 Reprogramação Celular O que é isso?

26 Reprogramação Celular Fatores Fatores de Yamanaka Fatores de Thomson C-MYC

27

28 Reprogramação Celular Fatores Fatores de Yamanaka Fatores de Thomson C-MYC KLF4

29 Klf4 p53 Nanog

30 Reprogramação Celular Fatores Fatores de Yamanaka Fatores de Thomson C-MYC KLF4 OCT4 SOX2

31

32 Reprogramação Celular Fatores Fatores de Yamanaka Fatores de Thomson C-MYC KLF4 OCT4 SOX2 NANOG

33

34 Reprogramação Celular Fatores Fatores de Yamanaka Fatores de Thomson C-MYC KLF4 OCT4 SOX2 NANOG LIN28

35 mirnas:

36 LIN28

37 Reprogramação Celular Fatores

38 Reprogramação Celular Fatores

39

40

41 Reprogramação Celular Metodologias: Critérios de pluripotência 1. Morfologia

42 2. Coloração por fosfatase alcalina

43 3. Expressão de marcadores de pluripotência WB

44 4. Formação de teratomas Tecido Neural (ectoderme) Cartilagem (mesoderme) Epitélio intestinal (endoderme)

45 5. Desenvolvimento de quimeras

46 Reprogramação Celular Limitações Baixa eficiência, alto custo, processo lento, variabilidade de protocolos

47 ES medium + LIF Feeder layer

48

49 Reprogramação Celular Limitações

50 Reprogramação Celular Fatores: Metodologias

51

52 Reprogramação Celular Fatores: Metodologias

53

54 Reprogramação Celular Fatores: Metodologias

55 Reprogramação Celular Limitações Alterações Reprogramação epigenética incompleta

56 Reprogramação Celular Limitações Aberrações cromossômicas

57 Reprogramação Celular Limitações mutagênese insercional

58 Reprogramação Celular Fatores adicionais: p53 Perda de p53 contribui com o aumento na reprogramação por meio de diferentes respostas: Inibição de senescência e morte celular Acelera a progressão do ciclo celular Possível redundância funcional entre super expressão de c-myc e perda de p53

59 Reprogramação Celular Fatores adicionais: p53

60 Reprogramação Celular Fatores adicionais: mirnas Família let-7: bloqueia a reprogramação interfere com a ativação de c-myc, lin28 e Sall4 mir-294: ativa a reprogramação ativa c-myc, lin28 e Sall4 Inibição de let-7 e ativação de mir-294 substituem a expressão exógena de c-myc durante a reprogramação.

61 Reprogramação Celular Fatores adicionais: mirnas Sox2 Oct4 Nanog Intensificadores de auto-renovação: mir (mir-372/373) mir-302 Intensificadores de diferenciação: mir-145 Let-7 mir-200

62 Reprogramação Celular Fatores adicionais: p53 e mirnas

63 Reprogramação Celular Fatores adicionais: p53 e mirnas Mantém a capacidade proliferativa da cél, e a célula c/ p53 pode responder de forma equilibrada resposta proliferativa vs. resposta apoptótica à indução de c-myc p53 mir-145 F.Y. Bom alvo p/ interferência, pq mantém a sinalização por p53, imp. p/ a supressão tumoral, sob controle. Silenciamento de mir-145 pode aumentar a eficiência de reprogramação s/ interromper a maquinaria de reparo ao DNA Reduz o crescimento celular

64 Reprogramação Celular Fatores adicionais Inibição de HDACs por ácido valpróico ou butirato

65 Reprogramação Celular e Câncer Vias de indução de pluripotência estão ligadas ao câncer P53 regula a indução de câncer mediada por oncogene tb regula a formação de ipscs. Myc reativação

66 Reprogramação Celular e Câncer Trabalhos recentes: expressão aberrante de oct4 induziu tumores em camundongos; Sox2 foi identificado como oncogene em pacientes com câncer de pulmão CSCs são enriquecidas em genes associados a ESCs. Formação de tumores (teratomas) é um dos critérios para avaliar indução de pluripotência

67 Reprogramação Celular e Câncer

68 Reprogramação Celular e Câncer * Indicíos do envolvimento de reprogramação na etiologia do câncer: pelo menos dois dos YF, c-myc e Klf4, também são oncogenes, e genes supressores tumorais, como a p53, bloqueiam o processo de reprogramação (Krizhanovsky and Lowe 2009). A expressão transitória destes genes seria suficiente para a reprogramação e possível indução do fenótipo tumoral (Lenz 2010).

69 Reprogramação Celular e Câncer * Pluripotência e tumorigênese são intricadamente ligados. É necessário preservar o potencial pluripotente e a autorenovação, mas ao mesmo tempo eliminar a tumorigenicidade (Knoepfler 2009). O grande desafio é a dissociação entre estes dois potenciais.

70 Reprogramação Celular Outros problemas

71 Agradecimentos

72 72

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