Tipos de Células-Tronco. Reprogramação Celular como alternativa de célula-tronco pluripotente. célula-tronco pluripotente!
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- Stefany Ramires Minho
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1 23/07/12 Tipos de Células-Tronco I Curso Teórico- Prá0co em Células- Tronco Pluripotentes Aplicações das Células-Tronco Pluripotentes Células- Tronco de Pluripotência Induzida ipscs células-tronco pluripotentes BRUNA PAULSEN 18 JULHO 2012 Células-Tronco Embrionárias como alternativa de célula-tronco pluripotente Reprogramação Celular como alternativa de célula-tronco pluripotente Resumo 1) Reprogramação celular 2) Geração de ipscs 3) Entendendo o processo de reprogramação 4) Limitações da utilização de ipscs célula somática célula-tronco pluripotente 5) Vantagens da utilização de ipscs 6) ipscs e Esquizofrenia (LaNCE) Algumas Limitações 1. Nem todas as doenças podem ser diagnosticadas em blastocistos; 2. Escassez de embriões. Principal Limitação Isso é possível? (já resolvida) Estratégias de Reprogramação Celular célula somática Estratégias de Reprogramação Celular célula-tronco pluripotente célula somática célula-tronco pluripotente Limitações Fusão celular Reprogramação Celular Evento muito raro; Ocorre naturalmente; Pode ser induzido. Fusão celular Só ocorre quando há fusão de núcleos. Evento muito raro; Ocorre naturalmente; Pode ser induzido. 1
2 23/07/12 Estratégias de Reprogramação Celular célula somática célula-tronco pluripotente Estratégias de Reprogramação Celular célula somática célula-tronco pluripotente Estratégias de Reprogramação Celular célula somática célula-tronco pluripotente Limitações Fusão celular óvulo Transferência nuclear (clonagem terapêutica) célula somática Fusão celular óvulo Não funcionou com a Transferência nuclear remoção dos cromossomos; (clonagem terapêutica) célula somática célula somática Transferência nuclear (clonagem terapêutica) Fusão celular Gerou células triplóides; Dificuldades técnicas; Limitações éticas e legais. Utilização de fatores definidos célula-tronco de pluripotência induzida ips naka Shinya Yama Shinya Yamanak a Geração de ipscs Mas, que genes utilizar? 24 genes candidatos (envolvidos com pluripotencialidade e proliferação) 1 Ecat1 2 Dppa5(Esg1) 3 Fbxo15 4 Nanog 5 ERas 6 Dnmt3l 7 Ecat8 8 Gdf3 9 Sox15 10 Dppa4 11 Dppa2 12 Fthl17 13 Sall4 14 Oct3/4 (Pou5f1) 15 Sox2 16 Rex1(Zfp42) 17 Utf1 18 Tcl1 19 Dppa3(Stella) 20 Klf4 21 β-catenin 22 c-myc 23 Stat3 24 Grb2 2
3 23/07/12 Estratégias para a reprogramação celular - ips Estratégias para a reprogramação celular - ips Seleção de 24 fatores Seleção de 10 fatores Oct4 Sox2 Klf4 Oct4 Sox2 Klf4 c-myc Estratégias para a reprogramação celular - ips Testes para confirmar reprogramação Seleção de 4 fatores Critérios Quarteto fantástico Morfológico Molecular Funcional Oct-4, Sox2, Klf4 e c-myc camundongo humano Padrão de expressão gênica; Padrão de metilação. Diferenciação nos 3 folhetos (in vitro); Formação de teratomas; Formação de quimeras; Complementação tetraplóide. Fatores de transcrição ipscs de camundongo 2006: INDUCTION OF PLURIPOTENT STEM CELLS FROM MOUSE EMBRYONIC AND ADULT FIBROBLAST CULTURES BY DEFINED FACTORS (Takahashi and Yamanaka, 2006) 2007: INDUCTION OF PLURIPOTENT STEM ipscs humana CELLS FROM ADULT HUMAN FIBROBLASTS BY DNA DEFINED FACTORS (Takahashi et al., 2007) 2007: INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL LINES DERIVED FROM HUMAN SOMATIC CELLS (Yu et al., 2007) Entendendo o processo de reprogramação Genes acessíveis Genes inacessíveis 3
4 23/07/12 Célula Somática Célula-Tronco Pluripotente cromatina cromatina (Plath e Lowry; Nature Reviews, 2011) (Plath e Lowry; Nature Reviews, 2011) Alterações feno7picas Aumento da proliferação Mudança do ciclo celular Alterações feno7picas Empacotamento de células CaracterísTcas de células epiteliais genes somáticos genes de pluripotencialidade Aparência pequena e arredondada CaracterísTcas de CTE sem telomerase e X inativado tem telomerase e X ativo Alterações transcricionais Down- regulaton de genes somátcos Up- regulaton de genes de proliferação e replicação do DNA Alterações transcricionais Up- regulaton de genes embrionários relacionados à proliferação e característcas epiteliais das CTE características mesenquimais características epiteliais Alterações na croma<na Alterações de expressão gênica restrita à regiões de eucromatna Alteração epigenétca de genes de pluripotencialidade sem que haja alteração na expressão gênica Alterações na croma<na Silenciamento dos genes exógenos (Plath e Lowry; Nature Reviews, 2011) Alterações feno7picas Colônias de células são óbvias Nível de Expressão Nível de Expressão Nível de Expressão Alterações transcricionais Up- regulaton de genes- chave e reguladores do estado de pluripotência Alterações na croma<na ReaTvação do Xi Perda da característca de cromatna repressiva em diversos genes de pluripotencialidade fatores exógenos" fatores endógenos" total" Células somá<cas Como os fatores de transcrição induzem a reprogramação? Como os fatores de transcrição induzem a reprogramação? fatores exógenos fatores endógenos fatores exógenos genes X somáticos Senescência Morte celular Barricada de supressores de tumor Barricada de supressores de tumor Estágios intermediários fatores endógenos fatores endógenos Transformação Parede da epigenétca Diferenciação ipscs 4
5 23/07/12 1) Alterações características do processo de reprogramação; Alterações características do processo de reprogramação 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs; Exemplos 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; Aberrações cromossomiais 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; Limitações da utilização de ipscs 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs Alterações características do processo de reprogramação Alterações características do processo de reprogramação Exemplos Exemplos Aberrações cromossomiais Reprogramação epigenética incompleta Aberrações cromossomiais Reprogramação epigenética incompleta Inativação incompleta do cromossomo X Ben- David et al., 2011 Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs 1) Alterações características do processo de reprogramação; 100% 100% 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs; 50% 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; Células- tronco pluripotentes (massa celular interna blastocisto) 50% 50% 50% 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; Células somátcas 50% 50% 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. 5
6 23/07/12 Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs Integração de fatores externos no genoma da célula Não integração de fatores externos no genoma da célula Integração aleatória de fatores no genoma Eficiência reduzida 1) Alterações características do processo de reprogramação; 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs; 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; Diferentes protocolos de cultivo das células podem aumentar a variabiliadade entre as linhagens de células-tronco pluripotentes. 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. (Plath e Lowry; Nature Reviews, 2011) Protocolos de diferenciação pouco eficientes Protocolos de diferenciação pouco eficientes Protocolos de diferenciação pouco eficientes Neurônios derivados a par<r de células- tronco pluripotentes Protocolos de diferenciação pouco eficientes Protocolos de diferenciação pouco eficientes 1) Alterações características do processo de reprogramação; Qual a estratégia ideal? 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs; 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; Cultura pura Cultura não pura 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. O melhor ainda é comparar com neurônios no cérebro de pacientes 6
7 23/07/12 Desafios na modelagem de algumas desordens Modelagem de doenças relacionadas ao envelhecimento, como Doença de Parkinson e Alzheimer, in vitro; Modelagem de doenças complexas, como algumas desordens mentais, in vitro e in vivo; Modelagem de doenças complexas com componentes epigenéticos, já que espera-se que o processo de reprogramação remova todas as alterações desse tipo. Desafios na modelagem de algumas desordens Desafios na modelagem de algumas desordens Modelagem de doenças relacionadas ao envelhecimento, como Doença de Parkinson e Alzheimer, in vitro; Modelagem de doenças complexas, como algumas desordens mentais, in vitro e in vivo; Modelagem de doenças complexas com componentes epigenéticos, já que espera-se que o processo de reprogramação remova todas as alterações desse tipo. (Saha e Jaenish, 2009) Desafios na modelagem de algumas desordens Modelagem de doenças relacionadas ao envelhecimento, como Doença de Parkinson e Alzheimer, in vitro; Modelagem de doenças complexas, como algumas desordens mentais, in vitro e in vivo; Modelagem de doenças complexas com componentes epigenéticos, já que espera-se que o processo de reprogramação remova todas as alterações desse tipo. Desafios na modelagem de algumas desordens Esclerose Lateral Aminiotrófica, Atrofia Muscular Espinhal, Disautonomia Familiar, Síndrome do X Frágil, Doença de Alzheimer, Síndrome de Timothy, Doença de Parkinson, Síndrome de Rett, Esquizofrenia. Identificação e reversão do fenótipo (comparação controles e pacientes) 1) Alterações características do processo de reprogramação; 2) Variabilidade nos protocolos de geração de hipscs; 3) Protocolos de diferenciação pouco eficientes; 4) Desafios na modelagem de algumas desordens; 5) Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente. Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente Processo caro, laborioso, lento e pouco eficiente dias dias dias Para gerar muitos pacientes ainda falta muita automatzação dias dias Valores considerando todo o processo: ~ R$45.000,00 (1 indivíduo) ~ 4-8 meses Estratégia Tipo Celular Eficiência Transdução Retroviral Quatro fatores (Oct4, Sox2, Klf4, c- Myc) Fibroblasto Embrionário Murino 0,1% Três fatores (Oct4, Sox2, Klf4) Fibroblasto Embrionário Murino 0,01% Três fatores (Oct4, Sox2, Klf4) Fibroblasto Humano 0,001% Três fatores (Oct4, Sox2, Klf4) + VPA Fibroblasto Humano 1% Dois fatores (Oct4, Sox2) Fibroblasto Humano 0% Dois fatores (Oct4, Sox2) + VPA Fibroblasto Humano 0,001% Transdução Adenoviral Quatro fatores (Oct4, Sox2, Klf4, c- Myc) Fibroblasto Pós- Natal Murino 0% Quatro fatores (Oct4, Sox2, Klf4, c- Myc) Hepatócito Murino 0,0006% Tranfecção Plasmidial Um plasmídio com Oct4-2A- Klf4-2A- Sox2- + um plasmídio com c- Myc Fibroblasto Embrionário Murino 0,0015% Referência: William E Lowry & Kathrin Plath Nature Biotechnology 26, (2008) Vantagens da utilização de ipscs 7
8 23/07/12 Vantagens da utilização de hipscs na modelagem de doenças Vantagens da utilização de hipscs na modelagem de doenças Vantagens da utilização de hipscs na modelagem de doenças Possibilidade de se acompanhar e detectar fenótipos alterados durante o processo de diferenciação; Possibilidade de se acompanhar e detectar fenótipos alterados durante o processo de diferenciação; Possibilidade de se acompanhar e detectar fenótipos alterados durante o processo de diferenciação; Variedade de tipos celulares gerados, garantindo uma melhor previsão da resposta terapêutica e toxicológica; Variedade de tipos celulares gerados, garantindo uma melhor previsão da resposta terapêutica e toxicológica; Variedade de tipos celulares gerados, garantindo uma melhor previsão da resposta terapêutica e toxicológica; Variedade de linhagens para uma mesma doença humana fornecendo informações sobre a variação genética e potencialmente epigenética de um amplo setor da população; Variedade de linhagens para uma mesma doença humana fornecendo informações sobre a variação genética e potencialmente epigenética de um amplo setor da população; Variedade de linhagens para uma mesma doença humana fornecendo informações sobre a variação genética e potencialmente epigenética de um amplo setor da população; Testes farmacológicos de forma paciente-específica, através da medicina personalizada. Testes farmacológicos de forma paciente-específica, através da medicina personalizada. Testes farmacológicos de forma paciente-específica, através da medicina personalizada. Vantagens da utilização de hipscs na modelagem de doenças Possibilidade de se acompanhar e detectar fenótipos alterados durante o processo de diferenciação; Variedade de tipos celulares gerados, garantindo uma melhor previsão da resposta terapêutica e toxicológica; Vantagens da utilização de hipscs na modelagem de doenças Variedade de linhagens para uma mesma doença humana fornecendo informações sobre a variação genética e potencialmente epigenética de um amplo setor da população; Testes farmacológicos de forma paciente-específica, através da medicina personalizada. Vantagens da utilização de hipscs na modelagem de doenças Genera0on of a model for the study of neural development in schizophrenia using human induced pluripotent stem cells (ips) ipscs e Esquizofrenia 8
9 23/07/12 Modelos experimentais Modelos experimentais Stevens Rehen POS- DOUTORADO Renata Maciel DOUTORANDOS Bruna Paulsen Cleide Souza Mariana Acquarone GRADUAÇÃO Ernesto Pozzaqo Hannah Drummond PESQUISADORES ASSOCIADOS Hamilton Silva MarTn Bonamino (INCa) Paulo Belmonte de Abreu (UFRGS) PROFESSORES COLABORADORES Antonio Galina (IBqM - UFRJ) Mariana Silveira (IBCCF - UFRJ) Helena Brentani (USP) Newton Castro (ICB - UFRJ) OUTROS COLABORADORES Leonardo Chicaybam (INCa) Raffael Massuda (UFRGS) Pedro Perdigão (UFRJ) Estudo das bases biológicas de doenças mentais Representação do estágio final da doença Cérebros post- mortem Até que ponto podem ser comparados a neurônios? Como induzir o transtorno? Que sintomas avaliar? Amostras de tecidos não neurais Animais Pacientes Simulações matemáticas Cultura de células Animais Pacientes Simulações matemáticas Cultura de células Esquizofrenia Esquizofrenia Etiologia Gêmeos idênticos são diferentes Sintomas Negativos Sintomas Positivos éticos Fatores Gen Fatores Ambienta is Modelos animais Déficits Cognitivos 1 em cada 100 pessoas Estudo das bases biológicas da esquizofrenia Estresse Oxida<vo e Esquizofrenia Fatores genétcos neurodesenvo lvimento Esquizofrenia e Estresse Oxida<vo Fatores ambientais Estresse oxida<vo Amostras de tecidos não neurais Cérebros post- mortem HipoaTvidade de receptores NMDA Alterações em neurônios PV Disfunção mitocondrial Alterações epigenétcas Alteração de respostas inflamatórias Anomalias oligodendrocítcas Defesas an<oxidantes ROS Esquizofrenia Modelos animais Células ips (Adaptado de Bitanihirwe e Woo, 2011) 9
10 23/07/12 Esquizofrenia e Estresse Oxida<vo Controle Paciente EZQ Controle Paciente EZQ fibroblastos Estabelecimento e expansão de fibroblastos fibroblastos Defesas an<oxidantes ROS Células ips Células ips ROS Precursores neurais NPC Precursores neurais NPC Tratamento de NPC Tratamento de NPC Estabelecimento e expansão de culturas de fibroblastos de pacientes esquizofrênicos Estabelecimento e expansão de culturas de fibroblastos de controles e pacientes esquizofrênicos Estabelecimento e expansão de culturas de fibroblastos de controles e pacientes esquizofrênicos Pacientes com esquizofrenia biópsia transporte da biópsia processamento das amostras expansão das células Controle Paciente EZQ Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle fibroblastos Reprogramação Células ips Precursores neurais NPC Tratamento de NPC Fibroblastos EZQ07 antes da transdução Fibroblastos EZQ07 depois da transdução 10
11 23/07/12 Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Fibroblastos EZQ07 transduzidos sobre MEF Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Fibroblastos EZQ07 transduzidos sobre MEF Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Colônia ips EZQ07 selecionada Reprogramação de fibroblastos de paciente esquizofrênico e controle Controle Paciente EZQ Caracterização morfológica de células ips geradas a partr de fibroblastos de paciente com esquizofrenia e controle fibroblastos Caracterização das células ips Células ips Precursores neurais NPC Tratamento de NPC Células ips têm morfologia semelhante a células-tronco embrionárias Alta razão núcleo:citoplasma Expressão de marcadores de pluripotencialidade em células ips de controle e de paciente com esquizofrenia ips Controle Diferenciação de células ips de controle e de paciente com esquizofrenia nos três folhetos embrionários Diferenciação de células ips em neurônios dopaminérgicos ips EZQ Co- cul<vo com células PA6 Células ips expressam marcadores de pluripotencialidade ips se diferenciam em células dos 3 folhetos embrionários Diferenciação neuronal gera células TH+ a partir de células ips 11
12 23/07/12 Corpos pulsantes a par<r de ips Diferenciação de células ips em neurônios funcionais Controle Paciente EZQ fibroblastos Células ips Diferenciação neural em NPCs Diferenciação gera neurônios funcionais a partir de células ips Precursores neurais NPC Tratamento de NPC Diferenciação direta de células ips em precursores neurais (NPC) Controle Paciente EZQ NPCs de paciente com esquizofrenia apresentam níveis de ROS mais elevados fibroblastos Células ips Iden<ficação do fenó<po alterado 51,9 ± 4,3% 53,7 ± 2,8% Precursores neurais NPC Tratamento de NPC Após diferenciação, população enriquecida em progenitores neurais Nível elevado de ROS no NPC do paciente é revertdo por ácido valpróico Controle Paciente EZQ fibroblastos Ácido Valpróico Estabilizador de humor Células ips Precursores neurais NPC Reversão do fenó<po alterado Tratamento de NPC VPA Regula a ex pressão de proteínas mitocondri ais; Aumenta a ex glutationa pressão de -S-transfera se 12
13 23/07/12 Conclusão neurodesenvolvimento Cérebros post- mortem Amostras de tecidos não neurais Modelos animais Células ips ufrj.org ufrj.org 13
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