28-Oct-17. COMO QUE OCORRE A TRANSIÇÃO DE totipotente PARA O ESTADO pluripotente? Zhou e Dean, 2015 Zhou e Dean, potencial diferenciação
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- Isabel Graça Deluca
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1 COMO QUE OCORRE A TRANSIÇÃO DE totipotente PARA O ESTADO pluripotente? Zhou e Dean, 2015 Zhou e Dean, 2015 potencial diferenciação 1
2 Cdx2 e Oct4 lentamente se tornam mutuamente exclusivos TEMPO Estes marcadores moleculares são NECESSÁRIOS para a definição de Trofoectoderme X MCI? A ausência de Cdx2 aumenta a expressão de Nanog e OCT4 na trofoectoderme A ausência de Cdx2 aumenta a expressão de Nanog e OCT4 na trofoectoderme A)Cdx2 reprime a identidade de Massa Celular Interna (MCI) B)Cdx2 é suficiente para a diferenciação de MCI C)Cdx2 é suficiente para a diferenciação de Trofoect. D)Cdx2 é necessário para a diferenciação de MCI A)Cdx2 reprime a identidade de MCI B)Cdx2 é suficiente para a diferenciação de MCI C)Cdx2 é suficiente para a diferenciação de Trofoect. D)Cdx2 é necessário para a diferenciação de MCI 2
3 A ausência de Cdx2 reduz a expressão de marcadores moleculares de trofoectoerma +/+ Cdx2 é necessário para a manutenção da identidade de trofoectoderma -/- Qual o MECANISMO MOLECULAR que regula a expressão gênicas no início da embriogênese? Oct4 Integrina alfa7 (Controle Epigenético 3
4 O silenciamento/ativação de genes ocorre de forma gradual Silenciamento Ativação As modificações epigenéticas ocorrem de forma ordenada: Metilação do DNA Modificação de Histonas Compactação Uma das enzimas que mantêm a metilação durante a replicação é a DNA metil transferase-1 (Dnmt-1) 4
5 As modificações epigenéticas ocorrem de forma ordenada: As histonas podem ser modificadas de várias formas. As principais são acetilação, metilação e fosforilação. Metilação do DNA Modificação de Histonas Compactação È um pouco mais complexo que isto: o AMINOÁCIDO modificado na Histona é importante também. ON OFF ON OFF Citosina Desmetilada Metilada Histona Acetilada Desacetilada Cromatina Aberta (eucromatina) Fechada (heterocromatina) 5
6 Você descobriu que o perfil epigenético de uma linhagem cancerosa é diferente do perfil de células normais. Quais destas alterações seriam mais prováveis de surgirem no câncer? Você descobriu que o perfil epigenético de uma linhagem cancerosa é diferente do perfil de células normais. Quais destas alterações seriam mais prováveis de surgirem no câncer? A. Metilação de promotores de genes supressores de tumor B. Metilação de promotores de genes de ciclo celular C. Metilação de promotores de citoesqueleto D. Todas as acima A. Metilação de promotores de genes supressores de tumor B. Metilação de promotores de genes de ciclo celular C. Metilação de promotores de citoesqueleto D. Todas as acima Você descobriu que o perfil epigenético de uma linhagem cancerosa é diferente do perfil de células normais. Que fármaco poderia ser útil para reverter as alterações epigenéticas? Você descobriu que o perfil epigenético de uma linhagem cancerosa é diferente do perfil de células normais. Que fármaco poderia ser útil para reverter as alterações epigenéticas? A. Ativador de metilação de DNA B. Fosforilador de Histonas C. Inibidor de DNMT D. Inibidor do ciclo celular A. Ativador de metilação de DNA B. Fosforilador de Histonas C. Inibidor de DNMT D. Inibidor do ciclo celular 6
7 ) Qual o MECANISMO MOLECULAR que regula a expressão gênicas no início da embriogênese? A metilação é necessária para manutenção da identidade de MCI A metilação é necessária para manutenção da identidade de MCI WT WT Dnmt1 -/- Trofoblasto: não Trofoblasto: não sim sim Ausência de atividade Dnmt-1 transforma MCI em trofoblastos (Pl1 +) Ng Nature Cell Biology 2008 Ng Nature Cell Biology
8 Ausência de atividade Dnmt-1 transforma MCI em trofoblastos Ausência de atividade Dnmt-1 transforma MCI em trofoblastos A) Aumenta o nível de DNA metilado e reduz expressão gênica B) Aumenta o nível de DNA metilado e aumenta a expressão gênica C) Reduz o nível de DNA metilado e reduz a expressão gênica D) Reduz o nível de DNA metilado e aumenta a expressão gênica A) Aumenta o nível de DNA metilado e reduz expressão gênica B) Aumenta o nível de DNA metilado e aumenta a expressão gênica C) Reduz o nível de DNA metilado e reduz a expressão gênica D) Reduz o nível de DNA metilado e aumenta a expressão gênica Análises de regiões diferentemente metiladas (DMR) no genoma identificaram a região promotora de Elf5 Massa Celular Interna Trofoblastos Ng Nature Cell Biology 2008 Metilado Não-metilado Elf5- é um fator de transcrição que ativa expressão de Cdx2 8
9 A diferença de níveis de Cdx2/Nanog zigótico é mantida por mecanismos epigenéticos Na MCI, a metilação da região genômica de Elf5 reprime sua expressão e, portanto de Cdx2 COMO QUE OCORRE A TRANSIÇÃO GENÔMICA DO GAMETA (terminalmente diferenciado) PARA O ESTADO totipotente? metilação Zhou e Dean,
10 ATORES otencial diferenciaçã o potencial diferenciação O citoplasma do ovo fertilizado degrada proteínas e RNAm Li et al. Development 137, (2010) 10
11 A condensação nuclear no espermatozóide ocorre com a substituição de Histonas por Protaminas O genoma haplóide de uma espermátide tem 5% do volume de uma célula somática diplóide No Núcleo masculino, as PROTAMINAS são substituídas por HISTONAS MATERNAS, e reidrata, expandindo o volume Sassoni-Corsi Science, 2002 (Zhou e Dean, 2015) Após a fecundação, o DNA do prónucleo masculino substitui protaminas por Histonas E SOFRE DEMETILAÇÂO G.Paterno G.Materno MIO Y., MAEDA K., 2008 American journal of obstetrics and gynecology 199: 660.e
12 Células marcadas com anticorpo anti-citosina metilada demonstram demetilação do prónucleo paterno antes da fusão A demetilação paterna ocorre ativamente, através de enzimas no citoplasma, enquanto a materna é passiva Prónucleo Feminino F F Corpúsculo Polar M M Prónucleo Masculino G.Paterno G.Materno No Pro-núcleo materno e no zigoto, até um estágio, ocorre a EXCLUSÃO do Dnmt-1 (demetilição passiva) No Pro-núcleo materno ocorre a EXCLUSÃO do Dnmt-1, de forma que divisões subsequentes resultam em DNA não metilado. 12
13 No período de implantação, ocorre a metilação de novo, que é mediada por Dnmt3a e Dnmt3b O processo de re-metilação ocorre mais fortemente nas células do Massa Nuclear Interna, que formarão o embrião propriamente dito A metilação é necessária para manutenção da identidade de MCI O nível de metilação do genoma varia durante as fases iniciais de desenvolvimento WT Dnmt1 -/- Trofoblasto: não sim sim Ausência de atividade Dnmt-1 transforma MCI em trofoblastos Ng Nature Cell Biology
14 MAS, existem regiões genômicas que NÃO SÂO DEMETILADAS O padrão de metilação dos gametas é diferente Os alelos paternos e maternos podem ser diferentemente metilados- IMPRINTING Este padrão é herdado e MANTIDO, de forma que em existem a) genes em que apenas o alelo materno é expresso b) genes em que apenas o alelo paterno é expresso 14
15 Patologias que envolvem genes imprinted têm manifestação sexo-dependente Patologias que envolvem genes imprinted têm manifestação sexo-dependente Patologias que envolvem genes imprinted têm manifestação sexo-dependente Surani et al. Nature,
16 Animais GINOGENÈTICOS apresentam defeitos de desenvolvimento Animais GINOGENÈTICOS E ANDROGENÈTICOS apresentam defeitos de desenvolvimento Surani et al. Nature,1984 Surani et al. Nature,1984 A) O alelo paterno de genes de crescimento somático são ativados B) O alelo materno de genes de crescimento somático são inativados C) O alelo paterno de genes de crescimento somático são inativados A) O alelo paterno de genes de crescimento somático são ativados B) O alelo materno de genes de crescimento somático são inativados C) O alelo paterno de genes de crescimento somático são inativados 16
17 UM DOS CROMOSSOS X é completamente metilado e inativado O gene que determina cor de pêlo em gatos fica no cromossomo X Como seria o gato que é heterozigoto para a cor de pelo? A) B) C) 17
18 A inativação do cromossomo X é randômica e gera um mosaico Na gametogênese, o cromossomo X paterno é inativado Na MCI do blastocisto, ambas cópias de cromossomo X são demetilados e uma cópia é re-metilada aleatoriamente. Na Trofoectoderma do blastocisto, a metilação do Xp é mantida. 18
19 RESUMINDO... REPROGRAMAÇÃO NUCLEAR Reversão de controles epigenéticos de diferenciação pelo citoplasma do ovo 19
20 Processo de clonagem por transferência nuclear O nível de metilação no promotor de Oct4 cai após a clonagem OCT4 Na clonagem, o padrão de re-metilação pode ficar aberrante (veja a MCI) Blastocisto normal Blastocisto clonado MCI MCI / 20
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