27/04/2015. Anteriormente... Dogma central. O fluxo da informação é unidirecional. Refutação definitiva da herança dos caracteres adquiridos

Transcrição

1 Anteriormente... Dogma central O fluxo da informação é unidirecional Refutação definitiva da herança dos caracteres adquiridos 1

2 O gene eucarioto Éxon constitui o mrna e se traduz em proteína Íntron sequência não transcrita Splicing do RNA No splicing alternativo, os éxons podem se juntar em combinações diferentes, produzindo mais de um tipo de polipeptídio a partir de um único gene. 2

3 3

4 5 H H OOC C N COH R N terminal H OOC C NH 2 R Ribossomo U A C A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U 5 3 RNA mensageiro Formação da ligação peptídica U A C A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U 4

5 Translocação Requer GTP H OOC C NH 2 R A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U H OOC C NH 2 R A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C G U U 5

6 H O H H H H OOC C N C C N C C N COH R H R OR A U G U U U C U U G A C C C C U G A G G C C A G Controle da Regulação Gênica José Francisco Diogo da Silva Junior Mestrando CMANS/UECE 6

7 Expressão gênica diferencial Quase todas as células de um organismo são geneticamente idênticas A expressão gênica é o processo em que a informação contida em um determinado gene é decodificada em uma proteína Diferenças entre os tipos celulares são resultado da expressão gênica diferencial, a expressão de diferentes genes pelas células de um mesmo genoma A expressão gênica é regulada em vários estágios Mecanismos para a criação de células especializadas As diferenças dramáticas que existem entre os diferentes tipos celulares é produzida por diferenças na expressão gênica 7

8 Como a célula controla quais proteínas ela fabrica? Controlando quando e como um determinado gene é transcrito Controlando como um transcrito primário de RNA sofre o splicing ou é processado Selecionando quais mrna são traduzidos Ativando ou inativando seletivamente as proteínas depois da sua síntese Controlando a velocidade de degradação das proteínas ativas Sinal NÚCLEO Cromatina Modificação da cromatina DNA Capa RNA Gene Exon Intron cauda Gene disponível para transcrição Transcrição Transcrito primário Processamento do RNA mrna no núcleo Transporte ao citoplasma CITOPLASMA 8

9 mrna no citoplasma CITOPLASMA Degradação do mrna Tradução Polipeptídio Processamento da proteína Degradação da proteína Proteína ativa Transporte para o destino celular Função celular Modificação da cromatina Genes presentes na cromatina altamente compactada geralmente não são transcritos A acetilação da histona parece soltar a estrutura da cromatina, melhorando a transcrição Transcrição Regulação do início da transcrição: os elementos de controle do DNA se ligam a fatores de transcrição específicos A metilação do DNA geralmente reduz a transcrição A dobra do DNA permite que ativadores se conectem a proteínas no promotor, iniciando a transcrição Regulação coordenada: Acentuado para genes específicos do fígado Acentuadores para genes específicos do pâncreas Modificação da cromatina Transcrição Processamento do RNA Degradação do mrna Tradução Processamento e degradação proteica Degradação do mrna Cada mrna possui uma meia vida característica, determinada em parte pela sequência nas UTRs 5 e 3 Splicing alternativo do RNA: Transcrito primário do RNA mrna Processamento do RNA ou Tradução O início da tradução pode ser controlado pela regulação dos fatores de iniciação Processamento e degradação da proteína O processamento e a degradação pelas proteassomas estão sujeitas a regulação 9

10 Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos 10

11 O que são fenômenos epigenéticos? São alterações herdáveis na expressão gênica sem modificações na sequência de bases do DNA Reversíveis Onde os processos epigenéticos ocorrem? DNA METILAÇÃO Promotor Silenciamento HISTONAS ACETILAÇÃO METILAÇÃO BIOTINILAÇÃO FOSFORILAÇÃO UBIQUITINAÇÃO SUMOilação Código de histonas Compactação da cromatina 11

12 Como os fatores de transcrição acessam o DNA? DNA empacotado para ocupar menos espaço na célula Organização de DNA, RNA e proteínas (histonas) em um complexo chamado cromatina Histonas proteínas que compõe a cromatina Heterocromatina DNA condensado Eucromatina DNA estendido EUCROMATINA/HETEROCROMATINA Vai depender do tipo celular que genes estarão ativos ou inativos Ativa Inativa 12

13 Histonas Determinam grau de condensação da cromatina reprime a transcrição Interação entre elas grupamentos adicionados Eventos epigenéticos: Acetilação (lisina) Metilação (lisina ou arginina) Fosforilação (serina) Ubiquitinação (lisina) Ribosilação Histonas As histonas possuem caudas que poder ser acetiladas pela enzima HAT (histona acetil transferase) A acetilação da histona faz sua carga (+) mais neutra, para que a interação com o DNA seja reduzida Grupo Acetil 13

14 Histonas As subunidades das histonas são: 2 unidades de H2A 2 unidades de H2B 2 unidades de H3 2 unidades de H4 A histona H1 não está no centro, mas age como um grampo e mantêm o DNA ligante no lugar As histonas são carregadas positivamente, por isso o DNA, que é carregado negativamente, se enovela ao seu redor DNA ligante liga um nucleossomo ao próximo Empacotamento do DNA como controle gênico 14

15 Influência da Estrutura da Cromatina na Transcrição em Eucariotos A maior parte do DNA em uma célula eucariótica está complexada nos nucleossomos e a estrutura espiralada dificulta o acesso de fatores de transcrição e da RNA polimerase. A iniciação da transcrição depende da remoção dos nucleossomos da região promotora do gene. Durante a síntese de DNA, quando os nucleossomos são substituídos, poderia haver competição entre as histonas e os fatores de transcrição (p.ex. TFIID) pelos sítios promotores. A ligação e ruptura dos nucleossomos por ativadores. Expressão gênica O DNA se enovela ao redor de proteínas de histonas para formar uma estrutura chamada nucleossomo. Os nucleossomos ajudam o empacotamento do DNA no cromossomo Quando grupos acetil se ligam a histona, o DNA nos cromossomos se soltam para permitir a transcrição A adição de grupos metil à histona pode causar a condensação do DNA e com isso prevenir a transcrição No imprinting genômico, a metilação regula a expressão tanto dos alelos maternos como dos paternos de alguns genes no início do desenvolvimento 15

16 Estrutura do DNA : nucleossomos e cromatina Unidade básica da heterocromatina NUCLEOSSOMOS Nucleossomos: aproximadamente 147 nucleotídeos enrolados sobre um octâmero de histonas com 2 cópias de cada tipo de histona Ativadores e cromatina Ativador se liga ao DNA Complexo de remodelagem da cromatina Remodelagem da cromatina Enzimas modificadoras das histonas: histona acetilases Modificação covalente das histonas Outros ativadores Outros ativadores ligados às regiões reguladoras Fatores de transcrição e RNA pol II conseguem acessar o DNA Montagem do complexo de iniciação no promotor Outros ativadores e rearranjo das proteínas do complexo INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO 16

17 Metilação do DNA Metilação do DNA Dinucleotídeos 5 CpG 3 : união de uma citosina a uma guanina por uma ligação fosfodiéster na mesma fita de DNA ilhas CpG regiões promotoras dos genes Metilação do DNA: ocorre normalmente em cerca de 70 a 80% dos sítios CpG, sendo que essa porcentagem aumenta com o envelhecimento. 17

18 Metilação do DNA É essencial para o desenvolvimento normal Tem ação: no controle da expressão gênica espacial e temporal na integridade cromossômica e segregação centromérica nos eventos de recombinação inativação do cromossomo X proteção contra elementos genéticos móveis imprinting genômico envelhecimento A remodelação da cromatina A acetilação das histonas melhoram o acesso à região promotora e facilita a transcrição 18

19 Metilação do DNA e controle da transcrição Uma pequena porcentagem do DNA recém sintetizado (~3% em mamíferos) são quimicamente modificados pela metilação A metilação ocorre mais frequentemente em sequências simétricas CG Genes transcricionalente ativos possuem níveis significantemente inferiores de DNA metilado do que genes inativos A metilação resulta na síndrome do X frágil; o gene FMR 1 é silenciado pela metilação Papel da Metilação/Desacetilação na Repressão do Genoma Ilhas CpG não metiladas e histonas acetiladas nucleossomos em configuração aberta cromatina descondensada acesso aos fatores de transcrição Genes transcricionalmente ativos 19

20 Papel da Metilação/Desacetilação na Repressão do Genoma Ilhas CpG hipermetiladas e histonas desacetiladas regiões de heterocromatina inativação gênica nucleossomos mais compactados cromatina condensada grupos metil fornecem barreira física para acessibilidade aos fatores de transcrição inibe acesso de proteínas reguladoras que promovem a transcrição Metilação do DNA O resultado da metilação do DNA: silenciamento dos genes através da inibição direta ou indireta da ligação dos fatores de transcrição devido ao processo de metilação 20

21 Baccarelli A et al. Circ Cardiovasc Genet 2010;3: REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO CA CANCER J CLIN 2010;60:

22 Imprinting genômico É um subgrupo distinto de regulação epigenética em que a atividade de um gene é reversivelmente modificada dependendo do sexo do genitor que o transmitiu Processo em que genes específicos são diferencialmente marcados durante a gametogênese parental expressão diferencial de alelos dependendo da origem materna ou paterna Imprinting genômico Assegura a expressão transcricional herdada paternalmente ou maternalmente Somente um dos 2 alelos parentais herdados é normalmente expresso e o outro alelo é reprimido Expressão monoalélica devido a padrão de metilação Imprinting pode ser tecido específico ou tipo celular específico: AS expressão monoalélica em neurônios mas não na glia. 22

23 Imprinting genômico Imprinting confirmado: Materno: 1, 7, 11, 14, 15, 18, 20 Paterno: 1, 6, 7, 11, 14, 15, 19 e 20 Entre 100 a 500 transcritos imprintados de 13 cromossomos diferentes Genes imprintados atuam no crescimento embrionário e desenvolvimento e outros influenciam o comportamento após nascimento. Consequência Funcional: Para que serve Funcionalmente estes genes serão haplóides. P M O gene A tem somente expressão materna (alelo paterno inexpressivo), enquanto o C somente paterna (alelo materno inexpressivo). O produto de ambos é o normal e suficiente para o funcionamento da célula. O gene B tem expressão em ambos os alelos, e seu produto também é normal para o funcionamento da célula. 23

24 Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos Exemplos de Sinais que Regulam a Expressão Gênica em Eucariotos Hormônios (ex: hormônios esteróides) Fatores de Crescimento e de Diferenciação Celular Contato célula célula (adesão celular) Alterações nutricionais (resposta é limitada!) Alterações ambientais (ex: choque térmico) 24

25 Regulação da expressão de genes por hormônios esteroides 25

26 26

27 Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos Fatores Gerais de Transcrição Os fatores gerais de transcrição são proteínas responsáveis: pelo posicionamento correto da RNA polimerase no promotor ajudam na separação das fitas de DNA, para permitir o início da transcrição e liberam a RNA polimerase do promotor quando a transcrição se inicia. 27

28 Região de controle gênica Região de controle gênica todo o DNA envolvido na regulação de um gene Quantidade de proteínas reguladoras de genes FTs são similares, as proteínas reguladoras do gene podem ser bastante diferentes para diferentes regulações gênicas Genes Eucarióticos São Regulados por Combinação de Proteínas A maioria das proteínas reguladoras de genes atuam como parte de um comitê de proteínas reguladoras, todas essenciais para a expressão de um determinado gene na célula correta, em reposta a uma dada condição, no tempo certo e no nível requerido. O termo controle combinatorial refere se a forma como grupos de proteínas trabalham juntas para determinar a expressão de um único gene. 28

29 Ação de fatores de transcrição gerais e seletivos Uma única proteína pode coordenar a expressão de diferentes genes Embora o controle da expressão gênica em eucariotos seja combinatorial, o efeito de uma única proteína reguladora pode ser decisiva para ligar e desligar, simplesmente completando a combinação necessária para ativar ou reprimir um gene. Exemplo: Em seres humanos, o receptor de glicocorticóide. Para se ligar aos sítios no DNA, o receptor precisa formar um complexo com uma molécula de um hormônio esteróide (p.ex. cortisol). Em resposta aos hormônios glicocorticóides, as células do fígado aumentam a expressão de vários genes. 29

30 Fatores cis e trans Fatores Trans Atuantes Genes que codificam estes fatores de regulação estão em outra região da molécula de DNA, tendo que migrar ao local de ação Ligam se ao DNA, mas provém de outra região do DNA, que os codifica para agirem sobre os fatores em cis Fatores Cis Atuantes Sequências reguladoras, região de ligação dos fatores transatuantes, estão na mesma molécula que o gene, ou transcrito de RNA, que está sendo regulado Estão na fita de DNA. São as regiões reguladoras, como as regiões promotoras dos genes, que são regiões que podem ligar ou desligar a expressão do gene Fatores cis e trans Ativadores Repressores Reforçadores Elementos isolantes Regiões reguladoras e regiões promotoras 30

31 Controle da expressão gênica Sob controle positivo A transcrição não se iniciará sem a formação do complexo de transcrição Fatores de transcrição são proteínas reguladoras que se ligam a região acentuador, ao promotor (TATA box) e uns aos outros Uma vez que os fatores de transcrição são formados ao redor do promotor, eles são chamados de complexo de transcrição Fatores de transcrição se ligam a região promotora 31

32 Fatores de transcrição diferentes se ligam a RNA polimerase Esse complexo de holoenzima reconhece o fator de transcrição original Acentuadores agem como ativadores da transcrição 32

33 DNA Acentuadores Ativadores Elemento de controle distal Promotor TATA box Gene DNA Acentuadores Ativadores Elemento de controle distal Proteína de dobra do DNA Promotor Gene TATA box Fatores de transcrição geral Grupo de proteínas mediadoras 33

34 DNA Acentuadores Ativadores Elemento de controle distal Promotor Gene TATA box Fatores de transcrição geral Proteína de dobra do DNA Grupo de proteínas mediadoras RNA polimerase II RNA polimerase II Complexo de iniciação da transcrição Síntese do RNA Regiões de controle da transcrição Promotores Sequencia de controle proximal no DNA Se liga a RNA polimersase e fatores de transcrição Taxa básica da transcrição Acentuadores Sequência de controle distal no DNA Ligante das proteínas de ativação Taxa melhorada (alto nível) da transcrição 34

35 Regiões de controle da transcrição Enhancer Promotor Elementos de controle Gene da Albumina Gene da cristalina NÚCLEO DA CÉLULA HEPÁTICA Ativadores disponíveis NÚCLEO DA CÉLULA OCULAR Ativadores disponíveis Gene da albumina expresso Gene da albumina não expresso Gene da cristalina não expresso (a) Célula hepática Gene da cristalina expresso (b) Célula ocular 35

36 Complexo de transcrição Proteínas de ativação proteínas regulatórias se ligam ao DNA em locais acentuadores distantes aumentam a taxa de transcrição Sítios acentuadores Sítios regulatórios no DNA distante do gene alvo Acentuador Ativador Ativador Coativator A B F E TFIID H Ativador RNA polimerase II Complexo promotor e iniciador principal Complexo de iniciação no sítio promotor sítio de ligação da RNA polimerase Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos 36

37 Mecanismos da regulação pós transcricional Apenas a transcrição não é o determinante para a expressão gênica Mecanismos regulatórios podem operar em vários extágios da transcrição Tais mecanismos permitem à célula promover uma sintonia fina na expressão gênica rapidamente em resposta à mudanças ambientais DNA PROMOTOR éxon 1 éxon 2 éxon 3 ATG TAA AATAAA TRANSCRIÇÃO 5 UTR íntron íntron Pre-mRNA CAP AUG NÚCLEO SPLICING DO RNA CITOPLASMA mrna AUG sequência codificante TRADUÇÃO OPEN READING FRAME 3 UTR UAA AAUAAA AAAAA UAA AAUAAA proteína MAPSSRGG.. Regulação da expressão gênica via regulação de mrnas maduros 37

38 Processamento normal do RNA Capeamento Logo após a transcrição Ligação efetiva de 7 metilguanosina ao primeiro nucleotídeo 5 do transcrito de RNA. Protege o transcrito do ataque da exonuclease 5 3 Facilita o transporte do mrna para citoplasma Papel no encaixe da subunidade 40S dos ribossomos no mrna Poli adenilação Após o término da transcrição clivagem terminal do RNA Adição de cerca de 200 resíduos de adenilato Facilitar transporte para o citoplasma Estabilizar o mrna Facilita a tradução Estabilidade do mrna regulando a expressão gênica 3 UTR possui elementos regulatórios que participam da estabilidade da transcrição Capa 5 : auxilia a exportação do mrna nuclear protege contra a degradação pelas exonucleases 5 3 no citoplasma seleciona transcritos para o ribossomo para tradução cauda poli A: participa da terminação da transcrição auxilia a exportação do mrna nuclear protege contra a degradação pelas exonucleases 3 5 no citoplasma seleciona transcritos para o ribossomo para tradução Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) 38

39 Estabilidade do mrna regulando a expressão gênica Em eucariotos: vida média de várias horas Desadenilases citoplasmáticas p.e. PARN Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Processamento do RNA No splicing alternativo, diferentes moléculas de mrna são produzidas a partir do mesmo transcrito primário, dependendo de qual segmento de RNA são tratados como éxons e quais são íntrons 39

40 Elementos de Acentuadores controle proximal (elemento de controle distal) DNA Upstream Promotor Éxon Íntron Éxon Íntron Sequência Poli-A Região de terminação Éxon Downstream Elementos de Acentuadores controle proximal (elemento de controle distal) DNA Upstream Promotor Transcrito primário de RNA 5 Éxon Íntron Éxon Transcrição Éxon Íntron Éxon Íntron Éxon Sequência Poli-A Região de terminação Íntron Éxon Downstream Final 3 do transcrito primário Sinal Poli-A 40

41 Elementos de Acentuadores controle proximal (elemento de controle distal) DNA Upstream mrna Promotor Transcrito primário de RNA 5 Íntron do RNA Éxon 5 Cap 5 UTR Íntron Éxon Íntron Éxon Íntron Éxon Processamento do RNA Segmento codificante Códon inicial Éxon Transcrição Códon final Íntron Sequência Poli-A Região de terminação Éxon Sinal Poli-A 3 UTR cauda Poli-A Downstream Final 3 do transcrito primário 3 Tipos de splicing alternativo 41

42 Regulação do transporte de RNA Somente mrna com estrutura de capa 5 e cauda poli A vão para o citoplasma Grande parte dos RNAs mensageiros nem saem do núcleo O mrna pode ir para locais específicos no citoplasma, próximo de onde a proteína atua Região 3 UTR é que quem regula esse direcionamento Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos 42

43 Início da tradução O início da tradução de mrna selecionados pode ser bloqueado por proteínas regulatórias que se ligam a sequências ou estruturas do mrna A tradução de todos os mrnas em uma célula podem ser regulados simultaneamente Por exemplo, fatores de iniciação da tradução são ativados simultaneamente em um óvulo logo após a fertilização Controle da tradução Bloqueio do início da tradução Proteínas regulatórias se ligam à porção 5 do mrna Prevenir a ligação das subunidades ribossomais e trna iniciador Bloquear a tradução de um mrna em protéina 43

44 Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos Processamento e degradação de proteínas Após a tradução, vários tipos de processamento proteico, incluindo a ligação e a adição de grupos químicos estão sujeitos a controle Proteassomas são complexos gigantes de proteínas que ligam moléculas de proteínas e os degradam 44

45 Processamento e degradação de proteínas Processamento de proteínas Dobramento, ligação, adição de grupos de açúcares, transporte par o sítio alvo Degradação de proteínas Ligação com a ubiquitina Degradação por proteasomas Regulação pela estabilidade da proteína Proteólise dependente da ubiquitina A molécula de proteína é sinalizada para degradação pela ligação de uma proteína de 20 kda, a ubiquitina NH 2 NH 2 + Molécula de proteína para degradação COOH ATP Ubiquitina ligase CO NH CO NH 26S proteasoma A estabilidade de uma proteína depende do aminoácido N terminal N terminal: por exemplo arginine, lisina: vida media = 3 minutos N terminal: por exemplo metionina, alanine: vida media = > 20 horas 45

46 Ubiquitina Proteassoma Proteassoma e ubiquitina para reciclagem Proteína a ser degradada Proteína Ubiquitinada Proteína entrando no proteasoma Fragmentos de proteína (peptídeos) Pontos de controle da expressão gênica em eucariotos 46