Replicação do DNA. Experimentos de Meselson-Stahl demonstraram a natureza semi-conservativa da replicação

Transcrição

1 Replicação do DNA

2 Replicação do DNA. Experimentos de Meselson-Stahl demonstraram a natureza semi-conservativa da replicação

3 Processo de replicação do DNA. Mediado por diversas enzimas Principais enzimas de síntese: DNA polimerases Nucleotídeo novo Direção de síntese (5 ->3 ) Fita DNA sintetizada Fita DNA molde

4 Replicação do DNA: contínua e descontínua Replicação continua. Replicação descontínua.

5 Ponto de junção Fita atrasada DNA parental duplex Fragmento de Okazaki Primer de RNA (~10b) Direção do movimento da forquilha Fita líder

6 A replicação de DNA é bidirecional a partir da origem A replicação progride do 5 para o 3 do DNA Inicia-se em um ponto da molécula e se estende em ambas as direções.

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8 A replicação bidirecional do DNA permite completar a tarefa em menor tempo Problema de tamanho: Genoma bacteriano +/ pb (pares de bases) DNA pol III sintetiza ~ 250 a 1000 bases por segundo Levaria entre 2:48 horas a 11 horas para completar o genoma E. coli se divide a cada 30 minutos (condições ideais) Genoma Humano: +/ pbs Tempo de replicação: 34 a 139 dias

9 A geometria do pareamento de bases contribui para a fidelidade da replicação A DNA polimerase é autocorretiva: Média de 1 erro a cada 10 7 pb 4

10 Genes e Cromossomos: Estrutura molecular

11 Definição molecular de gene Seqüência completa de ácidos nucléicos necessária para a síntese de um produto gênico funcional (polipeptídeo ou RNA)... O gene então é mais que a região codificante......inclui as regiões de controle

12 Organização cromossômica dos genes O genoma de diversos organismos têm muito DNA não funcional; A densidade de genes varia muito no cromossomo conjunto haplóide de cromossomos (Mb) Levedura 12 Drosophila 180 Galinha 1300 Homem 3300 Porém: - Amoeba dubia tem 200x mais DNA/cél. que o homem - Dentre os vertebrados os anfíbios têm o maior conteúdo de DNA/cél. - Tulipas: 10x mais DNA/cél. que o homem

13 Ao final do sequenciamento do genoma humano... 1,5 % correspondem aos éxons Maioria dos éxons variam de 50 a 200pb Íntrons são mais variáveis em tamanho tamanho médio= 3300pb ~1/3 do DNA genômico humano é transcrito em pré-mrna porém, 95% das seqüências são íntrons

14 Tamanhos de íntrons de genes de vertebrados

15 Principais Classes de DNA eucariótico e sua representação no genoma humano Número de cópias Fração do Classe Comprimento no genoma genoma humano(%) Genes que codificam proteínas Genes solitários Principais Classes de DNA eucariótico e sua representação no genoma humano Variável Genes duplicados ou que divergiram em Variável famílias de genes Genes repetitivos e consecutivos que Variável codificam rrnas, trnas, snrnas e histonas DNA repetitivo Seqüências simples Repetições intercaladas Transposons de DNA Retrotransposons LTR Retrotransposons não LTR LINEs SINEs Pseudogenes processados variável DNA espaçador não classificado variável

16 Genes solitários ou em família? Nos organismos multicelulares: genes solitários = genes que aparecem uma única vez no genoma haplóide (25 a 50% dos codificam proteínas). Genes duplicados = possuem seqüências semelhantes, não idênticas, com 5 a 50 kb de distância entre si (codificam proteínas). A duplicação cria uma família de genes codificam uma família de proteínas (homólogas)

17 Genes repetidos arranjos repetidos consecutivos de genes são vistos para DNA s que codificam rrnas e outros RNA não codificantes (snrna); cada cópia é igual (ou quase) a outra. Genes agrupados, mas não consecutivos são encontrados codificando trna s e histonas.

18 DNA repetitivo DNA de seqüência Simples ou DNA satélite (3% do genoma, a seqüência repetida é curta) Microssatélite: repetições com 1 a 13 pb (maioria de 1 a 4 pb) totalizando ~150pb Minissatélite: repetições de 15 a 100pb (20 a 50 unidades de repetição; 1 a 5 kb). O comprimento dos minissatélites caracterizam o indivíduo (fingerprinting). Satélite: repetições de 14 a 500pb em repetições de 20 a 100kb; Nos mamíferos a maior parte deste DNA está próximo aos centrômeros e telômeros

19 Geração de diferenças no comprimento de um DNA de seq. simples devido à recombinação desigual Arranjo consecutivo de seq. simples Cromossomos parentais (arranjos consecutivos iguais) Recombinação meiótica Cromossomos da cél. Germinativa (arranjos consecutivos desiguais) Divisão meiótica Células germinativas

20 DNA s de uma seqüência simples são marcadores cromossômicos importantes. Cromossomos humanos em metáfase corados e hibridizados com uma seqüência simples marcada

21 DNA móvel: moderadamente repetitivo Composto por grande n o de cópias de poucas seqüências de centenas a milhares de bases; Totalizam de 25 a 50% do DNA de mamíferos; São capazes de moverem-se no genoma: elementos transponíveis ou elementos móveis ou transposons; Há 2 grupos: tranposons de DNA e retrotransposons; É um evento raro, mas a eliminação é lenta...

22 Transposon de DNA DNA doador Sítio prévio do transposon Seqüências de DNA laterais DNA doador RNA polimerase Intermediário de RNA Intermediários de DNA Transcriptase reversa DNA alvo Elementos móveis transpostos

23 Estrutura geral dos elementos IS (seqüências de inserção) das bactérias Repetição invertida Região que codifica proteínas Repetição direta do sítio-alvo

24 Modelo da transposição de seqüências de inserção das bactérias

25 Estrutura geral doas retrotransposons LTR e um LINE (um retrotransposon não-ltr) Repetições terminais longas Repetição direta do sítioalvo (5-10pb) (Elemento intercalado longo) Repetição direta do sítio-alvo

26 A organização estrutural dos cromossomos eucarióticos Grandes quantidades de DNA são necessárias para codificar as informações-instruções para o desenvolvimento de um organismo Uma cél. humana típica tem ~2m de DNA O DNA precisa ser compactado! Nas cél. eucarióticas: o DNA dupla fita linear é associado com proteínas especializadas nos cromossomos Cromatina = DNA + proteína

27 As proteínas associadas ao DNA Envolvidas na: - compactação do DNA - expressão gênica; - replicação e reparo do DNA Nas células humanas, exceto germinativas, há duas cópias de cada cromossomo = cromossomos homólogos Os cromossomos aparecem em diferentes estados de condensação durante a vida na célula Só estão altamente condensados quando a célula está em divisão

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29 O estado de condensação varia com o ciclo celular Cromossomos mitóticos= altamente condensados Cromossomos interfásicos = geralmente estendidos Replicação Mitose Divisão celular Transcrição Tradução Interfase Fase M Interfase

30 Funções básicas de replicação do cromossomo são controladas por seqüências especializadas 1) Origem de replicação do DNA: onde a duplicação se inicia Cromossomo em metáfase 2) centrômero: seq. especializada de DNA que permite que uma cópia de cromossomo duplicado seja puxada p/ cada célula-filha na divisão celular; 3) telômero: seqüências repetidas encontradas nas extremidades do DNA. Permitem que as extremidades dos cromossomos sejam replicadas. Telômero Cromátide centrômero

31 O cromossomo

32 Os nucleossomos são unidades básicas da estrutura da cromatina Cromatina distendida Fibra condensada de 30nm

33 O nucleossomo é um complexo de: 8 histonas 2x(H2A, H2B, H3 e H4) + DNA fita dupla(146pb + ~50pb conector) Centro octamérico de histonas nucleossomo Histona H1

34 Estrutura do Nucleossomo resolvida por cristalografia de raios-x

35 Modelo de compactação da cromatina Cromossomo na metáfase Cromatina condensada associada ao suporte Fibra de 30 nm de cromatina formada pelos nucleossomos Interfase: cromatina estendida associada ao suporte Suporte do cromossomo Forma de colar de contas da cromatina Pequena região de DNA dupla hélice

36 Proteínas na cromatina Histonas Proteínas nãohistônicas do suporte: ancoram longas alças de DNA Outras proteínas: fatores de transcrição, proteínas de alta mobilidade Alças de DNA Proteína do suporte Micrografia eletrônica de um cromossomo em metáfase livre de histonas.

37 Após a mitose Cromossomos mitóticos desenrolam-se numa forma mais estendida = cromossomos interfásicos. Nestes a cromatina pode estar como: heterocromatina: + compactada ~10% do cromossomo (centrômeros e telômeros especialmente) transcricionalmente inativa eucromatina: forma menos condensada (~10%) Transcricionalmente ativa dobrada em nucleossomos (no mínimo) O restante: está entre a hetero e a eucromatina e é transcrito com dificuldade

38 Os cromossomos interfásicos são organizados dentro do núcleo O envelope nuclear é suportado por duas redes de proteínas fibrosas: - uma + organizada que suporta a membrana interna, chamada lâmina nuclear, - outra + desorganizada, externa. Partes dos cromossomos provavelmente se ligam a sítios do envelope ou da lâmina nuclear. Nucléolo: estrutura + evidente no núcleo interfásico sob microscopia óptica! Contém genes que codificam os RNAr Os genes são transcritos e as subunidades são montadas no núcleo, com proteínas importadas do citoplasma.