CONCURSO PÚBLICO DA FIOCRUZ GABARITO DA DISCURSIVA

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1 CONCURSO PÚBLICO DA FIOCRUZ GABARITO DA DISCURSIVA CARGO: PESQUISADOR EM SAÚDE PÚBLICA PERFIL: PE GENÉTICA HUMANA MOLECULAR (PE5021) 1ª QUESTÃO ESPERA-SE QUE O CANDIDATO, NO DESENVOLVIMENTO DO TEMA, TENHA FEITO CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS ADEQUADAS SOBRE OS SEGUINTES PONTOS: (a seguir relacione esses pontos de forma sintética) 1. Explique o que é o imprinting genômico, descrevendo as alterações epigenéticas no genoma humano, como os genes estão organizados e como é realizada a sua regulação O imprinting é um processo normal provocado por processos epigenéticos, que ocorrem na linhagem germinativa de um dos genitores, mas não no outro, em localizações características no genoma. Essas alterações incluem a modificação covalente do DNA, como a metilação da citosina para formar 5-metil-citosina, ou a modificação ou substituição na cromatina de tipos histônicos específicos, que pode influenciar a expressão genética dentro de uma região cromossômica. O imprinting ocorre durante a gametogênese, antes da fertilização, e marca alguns genes como proveniente da mãe ou do pai. Após a concepção, o imprinting controla a expressão genética dentro da região ïmprintada em alguns ou em todos os tecidos somáticos do embrião. A condição do imprinting persiste no pós-natal até a vida adulta através de centenas de divisões celulares. Os genes que sofrem o imprinting genômico raramente são encontrados em regiões isoladas. Em torno de 80% estão fisicamente ligados em um agrupamento (cluster) com outros genes imprintados. A organização em agrupamentos deve refletir a regulação coordenada dos genes em um domínio cromossômico. Há elementos controladores do imprinting (IC) em alguns agrupamentos que são necessários para seu controle ou para a expressão dos genes imprintados. Modificações covalentes do DNA (metilação), alteração da estrutura da cromatina e acetilação das histonas caracterizam os genes imprintados. Os genes imprintados são ricos em ilhas de CpG em palíndromo. Em linhagens germinativas, as ilhas de CpG estão associadas com genes não metilados e geralmente localizam-se na região promotora destes genes. A metilação destas ilhas desligam o promotor, um mecanismo de silenciamento. Consiste na adição de um radical metil (CH 3 ) no carbono 5 de Citosina, geralmente seguida por Guanina (dinucleotídeo CpG), catalisada por enzimas DNA metiltransferases (DNMTs). As regiões ricas em CGs, denominadas ilhas CpGs são caracterizadas por conterem mais de 500 pares de bases e destas, mais de 55% sendo CGs, geralmente localizadas na porção 5 do gene. Estima-se que as ilhas CpGs estejam presentes em cerca de 50 a 70% de todos os promotores de genes humanos, já as regiões com poucos CGs geralmente são localizadas em porções intergênicas e intrônicas. O mecanismo mais simples de como a metilação do DNA pode atuar no controle da expressão gênica é por meio do bloqueio do sítio promotor ao acesso de fatores de transcrição, havendo silenciamento do alelo metilado, ou seja, a metilação do DNA interfere diretamente na sequência de ligação de fatores. Nas fases iniciais do desenvolvimento, é verificado um nível baixo de

2 metilação global, com cerca de 30% das regiões metiladas, entre elas, regiões envolvidas na regulação do imprinting genômico. As modificações de histona atuam na regulação da transcrição gênica, pois interferem na condensação da cromatina que é estritamente relacionada a áreas de acesso ou não do DNA à maquinaria transcricional, podendo também recrutar e/ou impossibilitar o acesso a proteínas efetoras não- histonas. A acetilação da lisina na porção amino terminal da histona 3 (H3) ou histona 4 (H4), por exemplo, é encontrada em regiões ativas transcricionalmente, já a hipoacetilação é encontrada em regiões de baixa atividade. 2. Escreva sobre as síndromes de Prader-Willi e Angelman levando em consideração as características clínicas, incidência na população, localização cromossômica e as alterações genotípicas possíveis A Síndrome de Prader-Willi (SPW) é uma doença genética complexa, multissistêmica, caracterizada por anormalidades endócrinas, neurológicas e mentais. A síndrome ocorre em cerca de 1 para (a ) nascidos vivos e se caracteriza por uma fase neonatal apresentando hipotonia severa associada à dificuldade de sugar, com choro fraco e pouca atividade. Seu desenvolvimento neuro-motor é lento, tardam a sentar, engatinhar e caminhar. O período adulto é caracterizado por hiperfagia e severa obesidade, baixa estatura, hipogonadismo, características faciais, escoliose e um comportamento compulsivo-obsessivo. A SPW ocorre pela perda de função de genes localizados no cromossomo 15q Aproximadamente 70% dos indivíduos com a síndrome tem uma deleção na região 15q11.2-q13 no cromossomo herdado do pai, enquanto 25% tem uma dissomia uniparental materna, menos de 5% tem uma alteração na sequência do centro de imprinting, e menos de 1% tem um rearranjo estrutural cromossômico envolvendo a região 15q A herança de anomalias genéticas na região de 15q11-q13 é muito complexa. No entanto, o resultado final é a associação da SPW principalmente com a perda de expressão dos alelos paternos. A maioria (65% -75%) da SPW é devida às deleções de novo abrangendo cerca de 4 a 4,5 Mb do 15q11-q13. A outra alteração genética da SPW mais comum (20% -30%) é a dissomia uniparental materna (matupd), que surge na maioria ou em todos os casos de uma não-disjunção na meiose materna seguido de uma perda mitótica pós-zigótica do único cromossomo 15 paterno. A maioria das matupd provavelmente se origina de um erro na meiose I, devido à ocorrência de uma recombinação antes do defeito de segregação, resultando em regiões cromossômicas heterodissômicas e isodisômicas. Outras mutações menos comuns em PWS incluem dois tipos de defeitos de imprinting (ID), responsável por até 5 % dos casos. Essas podem ser tanto por sub deleções microscópicas de um elemento genético denominado centro de imprinting (IC) tanto por apenas uma impressão anormal (ou epigenótipo) e, consequentemente, nenhuma mutação. Em pacientes com SPW com defeitos de imprinting, o cromossomo de origem paterna tem uma mutação no IC ou uma epimutação, resultando em um epigenótipo materno. Existem cerca de 100 genes ou transcritos na região 15q11-q13 e cerca de 10 desses genes sofrem imprinting e são expressos através de herança paterna. Esta região pode ser dividida em 4 regiões: 1ª) uma região proximal que não sofre imprinting, contendo quatro genes biparentalmente expressos; 2ª) uma região de expressão somente paterna da SPW contendo cinco genes bem caracterizados que codificam proteínas (MKRN3, MAGEL2, NDN e SNURF-SNRPN), um cluster de cinco genes snorna (HBII-436, HBII-13,HBII-438, HBII-85 e HBII-52) e vários transcritos antisenso; 3ª) a região contendo genes de expressão preferencialmente materna UBE3A e ATP10A e 4ª) uma região distal que não sofre imprinting contendo um cluster de três genes receptores GABA, o gene P para o albinismo oculocutâneo tipo 2 (OCA2) e o gene HERC2.

3 A sindrome de Angelman com uma incidência de 1 para nascimentos (a ), é caracterizada pelo aspecto facial incomum, baixa estatura, grave retardo mental, espasticidade e convulções. Em 70% dos casos ocorre a deleção de, aproximadamente, a mesma região cromossômica da síndrome de Prader-Will, mas agora no cromossomo 15 herdado da mãe. Os pacientes com a síndrome de Angelman, portanto, possuem a informação genetica no 15q11-q13 derivado somente dos seus pais. Aproximadamente 3% a 5% dos pacientes possuem dissomia uniparental, com dois cromossomos 15 intactos de origem paterna. Em 5% dos casos, assim como na SPW, apresentam o defeito no centro de imprinting (IC). Mutações na cópia maternal de um único gene, o gene UBE3A que codifica uma ubiquitinaproteína ligase, causam a síndrome de Angelman em 10% dos casos. Este gene está localizado no 15q11-q13 e normalmente está imprintado (somente espresso a partir do alelo materno) no Sistema nervosa central. 3. Apresente e caracterize três técnicas moleculares que utilizem conversão bissulfídica para detectar o padrão de imprinting alterado nas síndromes de Prader-Willi e Angelman As 3 as técnicas moleculares de análise de metilação do DNA utilizando conversão bissulfídica para detectar o padrão de imprinting alterado nas síndromes de Prader-Willi e Angelman são: a conversão bissulfídica seguida de PCR convencional, a PCR metilação específica MS HRM e a análise de restrição após a conversão bissulfídica. A análise de metilação do DNA detecta 99% nos casos da SPW, incluindo todas as 3 classes: deleção paterna, dissomia uniparental materna e defeito de imprinting. A análise é realizada na ilha 5 CpG do locus SNURF-SNURP, região conhecida como centro de imprinting (IC). O promotor, o exon 1 e o intron 1 do SNURF-SNURP não são metilados no alelo paterno (expressos) enquanto que são metilados no materno (não expressos). O indivíduo normal possui os dois alelos enquanto os indivíduos com SPW tem somente o alelo metilado e indivíduos com AS tem somente o alelo não metilado. A análise de metilação permite a identificação do paciente com SPW porém não informa sobre a classe molecular da doença. Descrever a técnica de MS PCR Essa técnica é baseada no tratamento do DNA com bissulfito de sódio seguido de PCR usando primers específicos para diferenciar sítios metilados dentro das regiões exon1/promotora do gene SNURF/SNURPN. Descrever a técnica de MS-HRM: Utiliza a detecção do padrão de metilação das ilhas CpG. Tratamento do DNA com bissulfito de sódio, faz a conversão de citosinas não metiladas em uracila, impedindo a ligação dos primers Descrever a Análise de restrição após a conversão bissulfídica 2ª QUESTÃO ESPERA-SE QUE O CANDIDATO, NO DESENVOLVIMENTO DO TEMA, TENHA FEITO CONSIDERAÇÕES TÉCNICAS ADEQUADAS SOBRE OS SEGUINTES PONTOS: (a seguir relacione esses pontos de forma sintética) 1. Descreva as estratégias de sequenciamento NGS utilizadas atualmente no diagnóstico de doenças humanas.

4 - A resposta deverá abordar as três finalidades principais para a utilização do NGS: sequenciamento completo do genoma, sequenciamento do exoma e a construção de painéis multigênicos ou genes-alvo.; voltados para o diagnóstico O sequenciamento completo do genoma ou WGS (do inglês, Whole Genomic Sequencing) consiste no sequenciamento completo do genoma do paciente. Como resultado apresenta um mapa detalhado de mutações pontuais (em éxos e introns), inserções e deleções, além de informações minuciosas sobre alterações estruturais ou numéricas. - No sequenciamento completo do exoma ou WES (do inglês Whole Exome Sequencing) sequencia apenas as partes codificante para proteínas (aproximadamente 2%). Esta metodologia permite identificar alterações associadas a um determinado fenótipo clínico. Este tipo de abordagem possibilita selecionar regiões/variações de maior interesse, assim diminuindo o número de genes selecionados associados a etiologia da doença. Os dados gerados possibilitaram identificar resultados como mutações não sinônimas, sítios de splicing e em estado de homozigoze. - Os painéis multigênicos ou genes-alvo panel testing possibilitam a busca por variantes que podem estar associadas a fatores de risco para algumas doenças. Esta metodologia apresenta uma grande importância na área de genética médica, viabilizando o diagnóstico precoce de patologias com base no seu perfil molecular, o que impacta o aconselhamento genético de casais portadores de alelos mutantes. A utilização dos painéis possibilitam uma aplicação clínica mais objetiva pois confere rapidez na interpretação dos resultados e maior cobertura no sequenciamento dos genes de interesse. Com isso, torna-se possível montar perfis de genótipos associados a determinadas patologias. 2. Abordagem de NGS para detecção de mosaicismo em células somáticas citando exemplos. - A resposta deverá abordar que a tecnologia NGS permite identificar exatamente quantas moléculas foram sequenciadas (Número de leituras) determinar uma contagem precisa de variantes. - Em comparação com o sequenciamento do genoma completo ou do exoma, a utilização de painéis gênicos para o sequenciamento direcionado em geral fornece uma alta sensibilidade em relação aos demais. -Torna-se necessário ajustar o número de amostras por corrida, aumentando a sensibilidade e assim possibilitando a detecção de mosaicismo de baixa frequência com importantes consequências no diagnóstico, avaliação de risco e prognóstico. -Exemplo: A utilização da plataforma Roche 454 GS possibilitou a detecção de casos de Mosaico de baixo grau (variando de 8% a 24%) para mutações no gene retinoblastoma 1 (RB1) em pacientes com retinoblastoma, previamente diagnosticados como negativos pela análise de sequenciamento de Sanger. Um mosaicismo de alto grau foi identificado para o mesmo gene em pacientes previamente propostos a apresentarem mutações na linha germinativa devido à imprecisão na determinação da relação entre Normal /mutado por sequenciamento de Sanger. O mosaicismo foi confirmado em vários tecidos pela coleta de urina e swab bucal. Estas descobertas abrem novas perspectivas, sugerindo que cerca de 15% dos casos esporádicos de retinoblastoma são devidos a eventos pós-zigóticos e confirmando que a profundidade do sequenciamento é um método eficiente para distinguir inequivocamente mosaicos. Além disso, esses resultados têm implicações importantes em relação ao aconselhamento e assistência à família, alertando os indivíduos negativos pela análise de Sanger sobre o risco maior de recorrência devido ao potencial de envolvimento do mosaicismo

5 nas gônadas. Outras doenças têm sido associadas ao mosaicismo através do uso de NGS nos últimos anos e o diagnóstico através de painéis genéticos deve apresentar um alto nível de sensibilidade. - Comentar sobre o papel do mosaicismo associado à expressividade variável de distúrbios genéticos e o papel das tecnologias NGS nesse contexto. As tecnologias permitem avaliar melhor o impacto fenotípico destas alterações. 3. Identificação rápida e de baixo custo, utilizando NGS, no estudo de distúrbios geneticamente heterogêneos e descoberta de novos padrões de herança. - A tecnologia de NGS facilita o entendimento dos mecanismos envolvidos em distúrbios genéticos, além de ser o método mais eficaz para detecção e determinação de doenças de diagnóstico difícil, como por exemplo, subtipos de câncer e doenças heterogêneas. Possibilita detectar diferentes mutações dentro de um único gene que podem causar a mesma doença (heterogeneidade alélica) e mutações em vários genes diferentes podem estar relacionadas à mesma expressão clínica (heterogeneidade do locus), através da análise de vários genes em paralelo e padrões de metilação (epigenética) - A heterogeneidade genética tem sido descrita para vários distúrbios, e mutações específicas podem determinar fenótipos que segregam como dominante, recessivo, ou apresentam herança digênica ou apresentam traços trialélicos. A herança digênica é a forma mais simples de herança poligogênica e interação gênica para doenças geneticamente complexas. Esta condição é definida quando genótipos variantes em dois loci explicam os fenótipos de alguns pacientes e seus parentes não afetados quando comparados aos genótipos de um único locus. Além disso, existem evidências de modificação em transtornos mendelianos cujo impacto sobre o fenótipo é modesto em relação à um segundo loci, em herança digênica. - Muitas doenças são geneticamente heterogêneas, por exemplo: mutações identificadas em mais de 100 genes associadas à surdez e distrofias retinianas. Nesses casos uma abordagem de sequenciamento por painéis multigênicos, WES ou WGS, analisando vários genes em um único procedimento torna possível um diagnóstico oportuno. O sequenciamento por painel ou do exoma permitem uma maior profundidade (maior para painel) e garante uma análise de baixo-custo em comparação com o sequenciamento de todo o genoma. -Atualmente, os painéis gênicos são utilizados na triagem clínica de mutações em doenças genéticas, incluindo alguns tipos de câncer. Além de confirmar modos antecipados de herança, o sequenciamento com painel para vários genes ou exoma permitem identificar novos padrões de herança alinhados com a visão do padrão de transmissão de doenças genéticas, indo além da Mendeliana clássica. Os dados obtidos por NGS possibilitaram o estabelecimento da primeira base de dados de doenças com padrão digênico (DIDA, que atualmente inclui 213 Combinações digênicas envolvidas em 44 diferentes doenças digênicas. - A utilização de painéis para o sequenciamento orientado pode identificar variantes patogênicas com alta sensibilidade, alta qualidade de cobertura e profundidade, permitindo a distinção entre as mutações constitutivas da linha germinativa e o mosaicismo. O uso de painéis multigênicos adequadamente projetados para vias biológicas comuns ou o a analise por WES associados a disponibilidade de grandes pedigrees/coortes com caracterização clínica detalhada e estudos funcionais são fortemente recomendados para apoiar padrões complexos de herança

6 4. A utilização do perfil de RNA-seq no desenvolvimento de estratégias terapêuticas. O sequenciamento do RNA (RNA-seq) é uma tecnologia que permite o estudo abrangente do transcriptoma. Permite medir os padrões de expressão de milhares de genes simultaneamente e fornecer a percepção dos caminhos funcionais e da regulação dos processos biológicos. O RNA-seq permite determinar a estrutura da transcrição dos genes, em termos de seus locais de início e fim, padrões de processamento (splvcing) e outras modificações póstranscripcionais. Permite também a detecção de polimorfismos de nucleótidos (SNPs) em transcritos comparando-os com Transcriptoma de referência e quantificar a modificação da expressão de cada transcrito durante o desenvolvimento e ou sob diferentes condições. O RNA-seq provou ser uma ferramenta essencial para identificar genes e micro-rnas que conferem resistência a drogas durante o tratamento. Detecção de eventos de fusão gênica, devido a rearranjos cromossômicos, que acarretam em duas regiões genômicas não-continuas em um único transcrito estão presentes em aproximadamente 20% de câncer. Eventos de fusão EML4-ALK em amostras de câncer de pulmão foram identificadas por RNA-seq. Os resultados gerados podem ser detectados com análise por bioinformática de dados RNAseq. Vários métodos foram desenvolvidos para aumentar a Sensibilidade necessária para detectar junções de fusão. Um trabalho recente tem usado RNA-seq alvo que combina NGS com técnicas de captura para descobrir novos genes quiméricos em 467 Amostras de câncer. - A utilização dos dados de transcriptomica oriundas de neurônios derivados de Células tronco induzidas (ipsc) em desordens psiquiátricas tem auxiliado a descoberta de novos genes, vias metabólicas e sinalização celular que desempenham um papel central no desenvolvimento dos neurônios, desenvolvimento da doença e alvos para novas terapias. - O processo de reprogramação celular possibilitaria por engenharia reversa modelar fenótipos degenerativos de uma vasta gama de distúrbios com as síndromes de RETT e desordens psiquiátricas. 5. Descreva o processo para permitir uma análise mais acurada no diagnóstico, avaliação de risco de recorrência e elaboração de uma terapia personalizada, utilizando dados de NGS. - Embora o sequenciamento tenha sido um grande passo, apenas a prática e a caracterização clinica dos traços associados à doença (fenotipagem) podem dar um valor clínico a grande quantidade de informação genômica. - Assim, a "fenotipagem profunda" como tem sido chamada, reúne detalhes sobre as manifestações da doença para integra-los com a informação oriundas do sequenciamento e fatores ambientais, permite um diagnóstico mais preciso, para uma correta avaliação do risco de recorrência e à oportunidade de uma terapia personalizada. O procedimento é baseado em: -. avaliação clínica e caracterização fenotípica da doença, -. diagnóstico por sequenciamento NGS, que garante uma genotipagem completa (ou de um grupo de genes) do paciente através da análise de dados; -. Interpretação dos dados de acordo

7 com os achados clínicos e a reavaliação do paciente frente aos dados (fenotipagem profunda ou Fenotipagem) Devem-se considerar fatores adicionais como a diferente resolução diagnóstica entre estudos independentes como, por exemplo: cobertura incompleta; cobertura variável de regiões intrônicas flanqueadoras que podem incluir variantes degenerativas que afetam o processamento do RNAm, perda de variantes em regiões reguladoras intrônicas ou intergênicas, Histórico familiar, gravidade da apresentação clínica, tipo de transtorno, Idade do início da doença. Um processo integrado de dados clínicos e de grandes dimensões revela ser essencial para alcançar o diagnóstico clínico preciso, para avaliar um risco de recorrência correto e proporcionar a oportunidade de uma terapia personalizada